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鲍养殖过程中病害的发生日趋严重,严重制约了其养殖业的发展。常规药物和方法对鲍重大流行性疾病难以有效地控制。通过免疫学技术激发机体自身的免疫防御系统,提高机体对各种疾病的抵抗能力,才是解决疾病问题的根本办法。
一氧化氮(Nitricoxide,NO)作为一种新型生物信使分子、效应分子和免疫调节分子,广泛分布于生物体的各个器官和组织中,参与机体多种重要的生理病理活动,可以通过非特异性地杀伤细菌、真菌、寄生虫及病毒等,增强机体的非特异性免疫,因此成为近几年生命科学领域研究的热点。但在鲍方面的研究还较为少见。为此,本研究采用生化方法鉴定了杂色鲍(Haliotisdivericolor)血细胞中一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase,NOS)活性的存在,并研究了正常生理状态下与病理生理状态下鲍血清中NO/NOS的变化规律,分析了注射环磷酰胺和L-精氨酸对其体内NO/NOS的影响,比较了NO/NOS与其他免疫指标的关系,为研究NO/NOS在鲍免疫系统中的作用提供了理论依据。
1.杂色鲍血细胞中NOS活性的鉴定采用生物化学法,以副溶血弧菌和脂多糖为刺激因子,对杂色鲍血细胞中的NOS活性进行了初步鉴定,并采用硝酸盐还原酶法测定了NO的含量。结果表明:加入LPS或副溶血弧菌组的NO水平显著高于对照组(P<0.05),分别为对照组的1.84和1.92倍,而且这一反应能被NOS抑制剂L-NAME所阻断,说明杂色鲍血细胞中存在NOS活性。
2.注射副溶血弧菌对杂色鲍血清中NO/NOS的影响对杂色鲍足部注射浓度为5×105CFU·ml-1、5×106CFU·ml-1和5×107CFU·ml-1的副溶血弧菌悬浮液(剂量为O.1mm/只),分别在注射前及注射后6h、12h、24h、48h、96h、192h和240h足部取血,测定其血清中NO含量以及NOS活力的变化情况。结果表明,注射副溶血弧菌后杂色鲍血清中NO含量及NOS活力显著高于对照组(P<0.05),且NOS活力的最大值出现的较NO最大值早,NOS的最大值出现在注射后6h,而NO最大值出现在注射后12h。证明注射副溶血弧菌可以诱导杂色鲍NOS的表达,进而合成内源性NO,从而增加抵抗疾病的能力。NO含量的上升可以看作是机体对外界刺激的一种应答。研究结果为今后研究NO/NOS系统在软体类免疫中的作用提供一些理论依据。
3.患溃疡病和裂壳病鲍血清中NO/NOS及几种酶活力的变化情况对取自广东汕头的患病鲍血清中的NO/NOS、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)等活性进行了研究。患病鲍血清中NO/NOS、SOD、ACP/AKP比健康鲍均有显著提高(P<0.05),但LZM活性与对照组相比却显著降低(P<0.05)。实验结果表明自然发病与人工感染的结果基本一致,即外源性病原菌可以诱导鲍体内NOS的表达,进而提高鲍血清中NO的水平。
4.注射L-精氨酸和环磷酰胺对杂色鲍血清中NO/NOS的影响研究了注射L-精氨酸和环磷酰胺对杂色鲍血清中NO/NOS的影响。分别对杂色鲍每公斤体重注射250mg、500mg和1000mg的L-精氨酸和5mg、10mg、20mg的环磷酰胺的剂量,每隔5天足部肌肉注射1次,共注射3次。第16天检测其血清中NO含量以及NOS活性的变化情况。结果显示,注射500mg/kg的L-精氨酸可以显著提高实验鲍血清中NO的含量和NOS的活力,而10mg/kg的环磷酰胺则可以显著降低实验鲍血清中NO的含量和NOS的活力。为今后人为地调控鲍体内的NO含量、增强其自身的非特异性免疫功能,从而提高抵抗疾病的能力提供了理论依据。
5.NO/NOS与其他免疫指标的关系在前文工作的基础上,采用注射环磷酰胺的方法(剂量为10mg/kg),对杂色鲍血清中NOS活性进行了负调控,分别在注射后6h、12h、24h、48h、96h对NO/NOS、SOD、ACP、AKP以及LZM等活性进行了测定,并探讨了它们之间的相关性。研究结果表明,血清中NO/NOS、SOD、ACP、AKP、LZM等在注射环磷酰胺后有不同程度的降低,NOS与ACP、AKP以及LZM等的相关系数分别为0.8074、0.8292和0.7408,其相关显著或极显著,NO与SOD及LZM的相关系数分别为0.9302和0.9413,相关极显著。实验证明NO/NOS可以作为评价鲍免疫功能强弱的一个指标。