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研究背景：
脊髓损伤是一种高致残率的中枢神经系统损伤，该疾病不仅给患者本人带来极大的痛苦，同时也给家庭和社会带来沉重的负担。目前，临床上常采用外科手术、药物和物理康复等治疗脊髓损伤，但都不能完全解决患者不同程度的截瘫。因此，寻找一种安全、有效的脊髓损伤治疗方法具有非常重要的医学意义和社会价值。细胞移植是现在神经再生领域研究最多的治疗方法，也是最有可能治愈脊髓损伤的手段之一。当前可用于移植的细胞种类有诱导性多潜能干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、嗅鞘细胞、雪旺细胞等。由于胚胎干细胞具有无限增殖和多向分化的能力，因而具有较大的治疗潜能。但其移植后的定向分化、成瘤危险以及存活数量少仍然是亟待解决的问题。然而基因工程技术的推广使细胞的定向分化变得容易。文献报道，高表达Mash-1基因能够使小鼠畸胎瘤P19细胞和胚胎前体皮层细胞向神经元方向分化，因为Mash-1基因在哺乳动物的神经发生过程中起着关键作用。其次，前期的实验研究表明，益气化瘀方能够增加神经营养因子的表达，减轻周围神经损伤的炎症反应和细胞凋亡，具有促进神经损伤修复和运动终板再构筑的作用。因此，我们提出这样的设想：能否通过益气化瘀方改善损伤脊髓微环境，以增加移植细胞存活；Mash-1基因修饰使胚胎干细胞向神经细胞定向分化，二者联合共同促进脊髓损伤的修复?
目的：
1、观察Mash-1基因修饰后的胚胎干细胞在体内、外向神经细胞的分化情况；2、观察益气化瘀方联合Mash-1修饰的胚胎干细胞移植治疗脊髓损伤的作用。
方法：
1、采用PCR技术从小鼠脑组织cDNA中扩增出Mash-1基因，载体重组技术将Mash-1基因与MSCV载体连接，构建MSCV-Mash-1质粒。经过酶切鉴定和基因测序正确后，利用转染技术将Mash-1基因修饰到带绿色荧光的CE3胚胎干细胞上。经潮霉素筛选得到有Mash-1基因修饰的CE3细胞，并通过PCR技术检测修饰前、后CE3细胞的Mash-1基因表达情况。
2、将有和无Mash-1修饰的CE3细胞悬滴培养使其形成拟胚体，然后采用神经培养液贴壁诱导分化。通过显微镜观察细胞形态改变；细胞免疫荧光检测神经干细胞和神经元细胞的标记蛋白nestin和β-tubulinⅢ的阳性数目；rea1-time PCR检测胚胎干细胞的OCT3/4、内胚层的AFP、中胚层的Brachyury、外胚层的FGF5、神经干细胞的nestin、神经元细胞的tubulinⅢ标记基因的改变情况，比较有与无Mash-1修饰的CE3细胞在体外向神经细胞分化差别。
3、采用钳夹损伤建立小鼠急性脊髓损伤模型，于造模后第3天向损伤的脊髓部位注射有/无Mash-1基因修饰的胚胎干细胞。通过与模型组比较小鼠的后肢功能评分、脊髓的剩余面积以及神经营养因子、炎症因子和凋亡相关基因的改变情况，评价细胞移植对脊髓损伤的治疗作用。并通过免疫荧光检测OCT3/4、nestin、β-tubulinⅢ、GFAP的阳性细胞数目，比较两种胚胎干细胞在体内的分化情况。
4、采用相同的方法建立小鼠急性脊髓损伤模型，于造模后第3天开始给动物灌胃益气化瘀方汤剂，并向损伤的脊髓部位注射Mash-1基因修饰的胚胎干细胞。通过与模型组比较小鼠的后肢功能评分、脊髓的剩余面积以及神经营养因子、炎症因子和凋亡相关基因的改变情况，评价益气化瘀方和益气化瘀方联合Mash-1修饰的胚胎干细胞移植治疗脊髓损伤的作用。并通过免疫荧光检测OCT3/4、nestin、β-tubulinⅢ、GFAP的阳性细胞数目，比较单纯细胞移植与益气化瘀方联合细胞移植两组的移植细胞在体内的存活和分化情况。
结果：
1、通过逆转录病毒载体MSCV可将Mash-1基因稳定地修饰到CE3细胞上，使其高表达Mash-1基因。
2、与无Mash-1基因修饰的CE3细胞比较，有Mash-1修饰的CE3细胞在体外向神经干细胞和神经元分化的比率明显升高，同时促进神经外胚层相关基因FGF5、nestin、β-tubulinⅢ基因的表达。
3、与模型组比较，移植CE3和CE3-Mash-1细胞的小鼠运动功能均有明显提高。细胞移植可促进神经营养因子CNTF、NT-3的表达，减少炎症因子IL-1、TNF-α和凋亡相关因子caspase-3的表达，减少脊髓面积的丢失，从而提高动物的后肢运动功能。与移植无Mash-1基因修饰的CE3细胞相比，移植Mash-1基因修饰的CE3细胞在损伤的脊髓部位表达OCT3/4阳性的细胞明显减少，而表达神经干细胞nestin和神经元β-tubulinⅢ的阳性细胞明显增加，并减少移植细胞在移植部位形成团块。
4、与模型组比较，益气化瘀方能轻度提高小鼠运动功能，减少炎症因子TNF-α和凋亡基因caspase-3的表达。与单纯移植CE3-Mash-1细胞比较，益气化瘀方联合CE3-Mash-1细胞移植能进一步减少炎症因子TNF-α的基因表达水平，增加移植细胞在损伤部位的存活，进而提高小鼠的后肢评分。
结论：
1、利用逆转录病毒载体MSCV可将Mash-1基因修饰到CE3胚胎干细胞上；
2、高表达Mash-1基因能促进CE3胚胎干细胞在体外和体内向神经细胞分化；
3、移植Mash-1基因修饰的CE3胚胎干细胞能促进小鼠脊髓损伤的后肢功能修复，避免移植细胞在移植部位形成团块的危险；
4、益气化瘀方能减少脊髓损伤的炎症因子表达，增加CE3-Mash-1细胞在体内的存活数量，进而促进脊髓损伤的修复。