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Rho GTPase在细胞骨架相关的生命活动中如细胞迁移,轴突诱导,细胞周期等过程中发挥着重要的作用。白血病相关的Rho鸟苷酸交换因子(LARG),作为一种RhoA特异性的鸟苷酸交换因子,可以激活RhoA,有可能在白血病的形成过程中发挥着重要作用。LARG蛋白质具有四个结构域:PDZ,RGS,DH和PH结构域,其中DH/PH结构域直接参与底物的结合和RhoA的激活。 LARG PDZ结构域作为一个蛋白质-蛋白质相互作用的模块,可以与几种膜相关的蛋白质相互作用,如plexin B1,IGF-1受体和CD44,他们之间的相互作用可以激活RhoA,活化一系列的信号转导通路。通过这些相互作用,将胞外信号转化为胞内信号。LARG PDZ与plexin B1末端序列的相互作用可以促进RhoA的激活,调控细胞骨架的重排。 最近的研究表明Rho鸟苷酸交换因子中的PDZ结构域与配体的相互作用可以促使构象的变化,这些构象变化可以激活RhoA GTPase。我们通过三维核磁共振波谱(NMR)方法解析了LARG PDZ在自由和复合物状态下的溶液结构。LARG PDZ和plexin B1末端小肽形成复合物以后,结构发生了较为明显的变化,特别是βB/αB结合沟的底端部分;这种构象变化与其它PDZ在结合小肽前后发生构象变化的部位是不一样的。在其他PDZ中,构象变化主要发生在βB/αB结合沟的顶端部分。在结合小肽之前,LARG PDZ结构域中处于βB/βC和βE/αB loop区域的氨基酸残基在HSQC谱中没有共振信号,在加入小肽以后,两端柔件区域的氨基酸残基有了相对固定的构象。同时,我们研究了LARG PDZ结构域与其他配体相互作用的特性。为了寻找LARG PDZ结构域的结构变化以及柔性区域氨基酸残基信号消失的原因,我们探索了LARG-PDZ的动力学性质。通过简化的谱密度函数来分析主链弛豫数据,自由状态的LARG PDZ显示出较大幅度和范围的内部运动,包括皮秒-纳秒时间尺度和微秒-毫秒时间尺度。 βB/βC和βE/αB loop区域的氨基酸残基在两种构象或者多种构象之间进行交换,引起谱宽增宽而导致信号消失。通过CPMG实验,我们分析了自由状态下,低小肽浓度状态(蛋白质:小肽浓度比为10∶1)和处于复合物状态下的PDZ结构域的构象交换对于横向弛豫速率的贡献情况,以及构象交换的速率。在自由状态下,蛋白质的大部分氨基酸残基显示出毫秒量级的内部运动,它们主要集中在βB/αB结合沟上或者周围。在加入少量小肽之后,毫秒量级的运动更加明显,结合沟附近的氨基酸残基的构象交换对于横向弛豫的贡献更加明显,交换速率降低,此时的构象交换仍然属于快交换。加入过量的plexin B1末端小肽使99％以上的蛋白质处于结合状态,蛋白质和小肽之间的相互作用限制了蛋白质运动的空间自由性,此时蛋白质的内部运动大大减弱。在清楚的观察到LARG PDZ在自由和复合物状态下的结构变化以及明显的毫秒量级的内部运动性以后,我们希望探索蛋白质结构变化和动力学之间的关系。 突变实验和等温滴定量热(ITC)实验结果肯定了βB/αC和αE/αB loop区域的氨基酸残基的构象会影响LARG PDZ和小肽之间的相互作用。基于对结构和动力学性质的了解,我们对两者之间的关系有了初步的认识:βB/βC loop和βE/αB loop区域在不同构象之间的交换以及构象的易变性可以更好的辅助βB/αB结合沟进行构象的变化而容纳配体。蛋白质在结合沟附近的区域经历着明显的毫秒量级的内部运动,这种构象的柔性能够很好的帮助蛋白质进行不同的构象变化来结合不同的小肽。