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乳腺癌是西方女性发病率最高的恶性肿瘤，在我国女性发病率也逐年递增。针对雌激素受体(ERα)表达阳性的患者，内分泌治疗是乳腺癌综合治疗中的重要措施之一。Tamocifen是首选的药物，通过阻断雌激素与ERα的结合，抑制基因转录，抑制肿瘤细胞增殖，从而有效的缓解患者病情。但是超过50％的患者最初治疗有效，而后出现耐药，导致乳腺癌的进展或复发。因而，乳腺癌继发耐药问题是目前临床急需解决的重要问题。近年来发现，ERα的信号通路与其他信号通路发生交互作用(cross talk)与耐药产生有关。因而，清除ERα，避免cross talk的发生，有可能为乳腺癌患者、尤其为乳腺癌耐药的患者提供一种新的、有效的治疗策略。分子伴侣热休克蛋白90(Hsp90)与众多蛋白分子构象与稳定性的调节有关，Hsp90分子伴侣功能受到抑制时，这些底物蛋白会失去与Hsp90的结合而通过泛素-蛋白酶体途径降解。由于这些靶蛋白在肿瘤细胞增殖信号转导及抗凋亡过程中扮演着举足轻重的作用，抑制Hsp90的分子伴侣功能可以同时介导这些蛋白分子降解，起到“一石多鸟”的抗肿瘤治疗效果，因此Hsp90已成为抗肿瘤治疗的理想靶点。酪氨酸蛋白激酶Her-2是Hsp90的底物蛋白，多种恶性肿瘤中存在Her-2蛋白过表达，与不良愈后及肿瘤耐药密切相关。有研究证实，对于Her-2高表达的乳腺癌SKBR-3细胞系，Hsp90抑制剂能够通过抑制Hsp90功能，促进Her-2与Hsp90发生解离，在辅助分子伴侣，同时也是一种新型E3泛素酶CHIP的介导下，通过蛋白酶体途径降解。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)，是一类高效、低毒的新型抗肿瘤药物，目前多种HDACi，包括FK228、LAQ824、SAHA在美国已进入了Ⅰ期或Ⅱ期临床试验，具有明确的抗肿瘤作用。最初研究认为HDACi能够增强组蛋白的乙酰化水平，从而活化部分基因的表达，并介导肿瘤细胞的生长抑制、细胞分化及细胞凋亡。最近研究表明，HDAC抑制剂能够增强非组蛋白Hsp90的乙酰化水平，抑制Hsp90的分子伴侣活性，导致其多种底物蛋白如Her2、c-Raf、AKT等的降解，从而发挥抗肿瘤作用。对于ERα高表达的乳腺癌细胞系MCF-7，亦有研究证实HDACi能够有效清除ERα的表达，但是其作用机理并未深入探讨。我们在研究中发现HDAC抑制剂SAHA能够清除ERα蛋白，并促进ERα通过泛素。蛋白酶体通路降解，抑制MCF-7细胞增殖，促进其凋亡。本研究旨在进一步明确SAHA杀伤乳腺癌MCF-7细胞，清除ERα的表达的分子机制，并探讨E3泛素酶CHIP与SAHA介导的ERα降解之间是否存在相互作用关系。从而为治疗乳腺癌，解决乳腺癌耐药问题提供新的思路与策略。研究内容及结果：1．SAHA对MCF-7细胞生物学特性的影响MTT实验结果表明SAHA呈时间剂量依赖性地杀伤MCF-7乳腺癌细胞，流式细胞仪测定显示阻断细胞周期于G2/M期。瑞氏—姬姆萨染色显示，SAHA可使MCF-7细胞的形态发生明显改变，由多边形转变为梭型。2．SAHA介导MCF-7细胞杀伤的分子机制1)SAHA有效清除ERα的表达；通过RT-PCR及Western blotting实验证实，SAHA可抑制ERα的蛋白表达，其机制涉及抑制ERα的合成及促进ERα降解两个方面。通过阻断蛋白酶体通路及免疫共沉淀证实SAHA诱导ERα通过泛素-蛋白酶体通路降解。伴随ERα蛋白表达的下降，ERα的转录活性也随之下降。2)SAHA介导ERα降解是通过增强Hsp90乙酰化，抑制Hsp90分子伴侣功能实现的；免疫共沉淀实验证实Hsp90在SAHA作用后随作用时间的延长，其乙酰化水平明显增强，同时伴随Hsp90乙酰化的增强，ERα与Hsp90的结合却明显减少。除ERα外，细胞内多种Hsp90底物蛋白，包括Raf-1、Cdk4、Survivin等也都发生了完全或部分的降解，证实SAHA使MCF-7细胞内Hsp90分子伴侣功能受到了抑制，导致了ERα与Hsp90的解离及降解。3)阻断了MCF-7细胞生存信号转导通路，导致细胞凋亡；SAHA不仅可以有效地清除ERα，同时清除信号通路中多种激酶蛋白，伴随着激酶蛋白的清除，下游的Akt激酶和Erk激酶的磷酸化受到了明显抑制，细胞内两条重要的生存信号通路PI3K-Akt和Raf-Mek-Erk被阻断，细胞发生凋亡。3．E3泛素酶CHIP参与ERα降解过程瞬时及稳定转染证实CHIP能够促进ERα的蛋白降解，其对ERα的mRNA水平没有明显影响。CHIP促进ERα的降解依赖于TPR结构域与U-box结构域的同时存在。4．E3泛素酶CHIP参与SAHA介导ERα降解过程本部分实验中，采用稳定转染空载体、CHIP、CHIPΔTPR(TPR结构域缺失体，不能与分子伴侣结合)、CHIPΔU-box(U-box结构域缺失体，不具备E3泛素连接酶的功能)的MCF-7细胞株为研究模型。首先Western blotting实验证实CHIP能明显促进SAHA对ERα蛋白的降解。然后通过免疫共沉淀实验证实，发现随SAHA作用时间延长，ERα与CHIP的结合增加，而且，CHIP在此过程中增强了ERα蛋白的泛素化，因而提示CHIP作为E3泛素酶参与了SAHA介导ERα降解过程。只有在MCF-7WT细胞中，药物处理前后ERα较其他组有更明显的下调，提示CHIP的E3泛素酶功能的发挥依赖于其与分子伴侣的结合。5．不同配体对ERα与CHIP之间相互作用的影响采用MCF-7WT稳定转染细胞株，SAHA预处理后，不同的配体对ERα与CHIP之间的相互作用影响并不相同，提示不同配体作用于MCF-7细胞，ERα的降解方式并不相同。结论：组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA可有效清除ER并抑制其介导的信号传递，其分子机制涉及抑制ERα的合成及通过增强Hsp90乙酰化而抑制其分子伴侣功能，促进ERα经蛋白酶体通路降解。新型E3泛素连接酶CHIP介入了SAHA诱导的ERα的降解过程。