论文部分内容阅读
为了研究贝类GSTs在海洋环境污染检测方面的应用,需研究GSTs在贝类各种组织中的特异性分布和在不同组织中的活性差异.首先通过GSH-Sepharose4B亲和层析柱分别从对生蒴蛤、长肋日月贝、环纹坚石蛤和紫贻贝四种海贝的肝肠、腮、外套膜、闭壳肌以及包被肝肠的肌肉组织中获得初步纯化的GSTs粗酶液;经SDS-PAGE分析所获粗酶的组织特异性,用CDNB、NBD-Cl、4-NPA、ECA等四种底物检测所获粗酶的催化活性和底物特异性.结果表明每种组织均有2-3种同工酶;对生朔蛤、环纹坚石蛤中GSTs耦联CDNB的总活性50﹪以上由肝肠组织提供,而在其它两种贝类中这种优势不明显;四种贝类的肝肠组织与同一种贝的其他组织相比具有最高耦联CDNB的酶比活.为进一步研究上述贝类肝肠组织的GSTs同工酶,先后从对生朔蛤、环纹坚石蛤、紫贻贝的肝肠组织中通过亲和层析与反相HPLC分离纯化GSTs.反相HPLC柱的洗脱图谱表明,对生朔蛤、环纹坚石蛤肝肠组织有两种GSTs同工酶,而紫贻贝的肝肠组织有三种GSTs同工酶.将上述组织中作为主要成分的同工酶依次命名为AdGST、AsGST和MeGST.它们均为同源二聚体,亚基分子量分别为23.18kDa、24kDa与23.6kDa,等电点分别为4.6、5.5与5.8,均含有较多的非极性氨基酸与酸性氨基酸.三种酶对CDNB与ECA有很强的活性,而对NBD-Cl、4-NPA的活性较低.上述性质结合N-末端序列分析认为AdGST属于sigma类同工酶,而AsGST、MeGST为pi类同工酶.最终根据相近物种间GSTs基因一级序列的相似性设计引物,从紫贻贝的肝肠组织中克隆得到包含618bp阅读框的完整GST的cDNA序列.该基因编码的酶蛋白N-末端15个氨基酸与已经测定的天然MeGST的序列完全一致,从而克隆所得的基因即是前述MeGST的编码基因.在大肠杆菌BL2用载体pET-30a+表达MeGST基因.通过优化表达条件,于25℃、1mMIPTG条件下可溶性表达的重组MeGST含量占全菌蛋白的30.7﹪.经过Ni2+螯合柱和亲和层析获得重组MeGST,并进行了酶学性质以及光谱学性质的研究.最后通过生物信息学手段以网络和生物软件为工具分析紫贻贝肝肠谷胱甘肽硫转移酶的结构与活性中心.生物信息学分析再次确认了MeGST为pi类GST.通过系统进化分析确定其处于无脊椎动物到脊椎动物的过渡期.同源模拟了紫贻贝肝肠谷胱甘肽硫转移酶的三维结构,发现N-末端结构域包括一个β-α-β-α-β-α的结构基元,其中β折叠是以反平行的方式形成的混和三链β-折叠片;C-末端结构域是一个纯α-螺旋,其核心由四个螺旋(α 4/α 5/α 6/α 7)形成的束组成.通过MeGST与GSH的对接发现MeGST中Tyr6、Trp38、Gln50、Leu62、Ser65是与GSH结合最重要的功能氨基酸.