论文部分内容阅读
4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)是木质素合成途径中一种很关键的限速酶。本实验室已经成功克隆出5个4CL基因,分别命名为4CL1～4CL5基因。根据文献,4CL含有两个保守结构域BoxⅠ和BoxⅡ。在两个结构域间含有12个特殊氨基酸,这些氨基酸与底物的特异性有重要的关系,其中缺失VAL残基的4CL突变体能获得催化芥子酸的活性功能。因此,本实验选择在相同的位点,构建了VAL缺失突变体。
本研究的主要内容涉及突变基因的获得,突变4CL基因、正义4CL基因的各种载体构建。取突变的4CL1～4CL5基因构建原核表达载体,进行原核表达与蛋白纯化,并最终获得目标蛋白,待用作下步的酶活力测定。同时取正义4CL1～4CL5基因构建转基因表达载体4CL-PBI121,用农杆菌叶盘法转化植株烟草,获得一批抗性烟草。对获得的抗性烟草,经PCR、southern杂交确认目标片段的转入。每个基因,最后得到五个阳性株系,每个株系取三株进行检测。经检测,转化正义4CL4基因的转基因植株的根部,木质素含量有显著性变化。