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研究背景：
脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellar ataxia SCA)是一组由遗传因素造成的神经系统变性疾病，临床主要表现为小脑性共济失调，伴眼肌麻痹、锥体系/锥体外系症状、痴呆、视网膜病变、周围神经病变等症状。其病理改变主要累及小脑皮质、齿状核、脑桥核和下橄榄核及脊髓。
随着分子生物学的发展，目前有基因定位的SCA亚型已经有近30种。在这一大组疾病中，SCA1、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17和DRPLA是相应致病基因存在CAG扩增位点，导致三核苷酸重复(Trinucleotide repeat，TNR)数目的变化即动态突变(Dynamic mutation)引起的，因而又属于三核苷酸重复性疾病(Trinucleotide repeat disease，TRD)。CAG编码谷氨酰胺，所以CAG重复扩增导致的这一类疾病又称为多聚谷氨酰胺疾病(Polyglutamine，polyGln，PolyQ)。至今为止，SCA确切的发病机制尚不清，目前的研究提示涉及核内包涵体及泛素—蛋白水解酶通路、转录下调、轴突运输障碍、钙离子失衡、线粒体功能障碍等在内的多个因素。
SCA各亚型在不同国家、地区和种族发病率有极大的差异，但在大多数国家和地区(包括我国)，SCA3所占的比例最高，占SCA的40％—48％，它是位于染色体14q32.1上的Ataxin—3基因CAG重复扩增引起的。正常人CAG重复次数为14-37次；患者为56-84次。现阶段用于研究SCA3发病机制的模型主要有两种：体内模型和体外模型。由于体外模型可以用于分子学发病机制的研究，较体外模型需要的技术简单，得到广泛应用。体外模型主要有瞬时转染，稳定转染和可诱导细胞模型，细胞类型主要有PC12，COS—7，HEK293等。课题组以前曾用PC12建立过瞬时转染SCA3的细胞模型，经实验者证实这种细胞可以用于SCA3发病机制的研究。但是瞬时转染细胞模型的转染率比较低，难以发现干预后的细微变化；每次转染效率很难完全一致，实验的可重复性也比较差，所以本实验决定建立SCA3的可诱导PC12Tet—On细胞模型。
研究策略：
1、载体的构建
2、PC12Tet—On细胞的培养及转染
3、单克隆的筛选及鉴定
4、细胞模型经NGF诱导为神经元后的鉴定
方法及结果：
一、载体的构建
1、目的基因的获取
将带有正常CAG重复次数的pEGFPC1Ataxin—3Q28和异常CAG重复次数的pEGFPC1Ataxin—3Q84分别用primer5.0进行酶切位点的分析，选取合适的酶切位点，将带有正常和异常CAG重复次数的Ataxin—3基因从pEGFPC1质粒切下来，琼脂糖电泳将Ataxin—3片段与pEGFPC1片段分离，回收得到Ataxin—3片段。
2、将目的基因连接到pTRE2Hyg2-Myc载体中
在pTRE2hyg2-Myc的多克隆位点上选择合适的限制性内切酶将载体双酶切，将回收的含有正常和异常CAG重复次数的Ataxin—3基因分别用T4连接酶连接到pTRE2hyg2-Myc中。
3、载体的鉴定
将构建好的pTRE2Hyg2-Myc—Ataxin—3Q28、pTRE2Hyg2-Myc—Ataxin—3Q84与不带有目的基因的pTRE2Hyg2-Myc经琼脂糖电泳鉴定，并用作测序鉴定，发现与文献报道序列一致。
二、PC12Tet—On细胞的转染
1、筛选单克隆药物浓度的确定
将2×105个细胞接种到的10cm的培养皿中，培养基中分别加入0、50、100、200、400、800ug/ml的潮霉素B，隔天显微镜下观察，每4天换液一次，按PC12Tet—On细胞说明书选取培养5天开始出现大批细胞死亡，第14天细胞基本死亡的潮霉素B的浓度。本实验选取浓度为：200ug/ml。
2、PC12Tet—On细胞的转染
将PC12Tet—On细胞接种于10cm的培养皿中，待到细胞长到80％融合的时候，用lipofectamine2000分别将pTRE2Hyg2-Myc—Ataxin—3Q28及pTRE2Hyg2-Myc—Ataxin—3Q84转染细胞。
三、细胞模型单克隆的筛选及鉴定
1、单克隆的筛选
将转染后的PC12Tet—On细胞用含有200ug/ml潮霉素B的培养基培养，约2周后可以在显微镜下看到转染成功的细胞团，1个月后，肉眼可以看到转染成功的细胞团，每种转染的细胞分别选20个克隆，将细胞重悬种在24孔板。
2、细胞模型的Western blot鉴定
将每种细胞的克隆种在25cm的培养瓶中，培养到90％融合时，传代后，种到60mm培养皿中培养，加DOX培养4天，收蛋白，做Western blot，每种细胞选择表达最强的3个克隆：PC12Tet—OnAtaxin—3Q28选1、9、17；PC12Tet—OnAtaxin—3Q84选3、4、16。再将这3个克隆分别种在60mm的培养皿中，不加DOX，培养4天收蛋白，做Western blot，选取基础表达最低的克隆：PC12Tet—OnAtaxin—3Q28选1；PC12Tet—OnAtaxin—3Q84背景表达都比较高，在诱导表达次高的4个克隆1、9、12、14中选取背景表达最低的克隆1。
3、细胞模型的免疫荧光鉴定
将Western blot选取的细胞模型种皿，分别作加药诱导，诱导培养后免疫荧光鉴定，发现Ataxin—3有表达。
四、NGF诱导为神经元后Ataxin—3基因的表达
将PC12Tet—OnAtaxin—3Q28和PC12Tet—OnAtaxin—3Q84种在60mm培养皿中，NGF诱导为神经元细胞做Western blot发现转染的Ataxin—3仍有表达。
结论：
本实验建立了脊髓小脑性共济失调3型的可诱导细胞模型，可以根据需要调控基因表达，便于研究早期发病机制。此外，脊髓小脑性共济失调3型中虽然致病蛋白Ataxin—3可以在各种非神经组织中表达，但主要表现为神经系统的毒性。PC12可以被NGF诱导为神经元细胞，所以我们的细胞模型更适合于研究讨脊髓小脑性共济失调3型主要表现为神经系统损害的机制。