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众多大型临床研究结果表明急性心肌梗死(AMI)患者合并高血糖(血糖水平≥11.1mM)时死亡率升高,同时血管再通后冠脉微循环障碍、充血性心力衰竭、心源性休克及猝死等并发症的发生率均较血糖水平正常的AMI患者显著增加,提示高血糖与AMI患者预后不良密切相关。葡萄糖-胰岛素-钾液(GIK)应用于临床治疗AMI已经有40余年的历史。然而有关GIK是否能降低AMI患者死亡率,几项大型GIK临床研究的结果存在很大分歧。研究分析后发现,当GIK输注过程中同时存在高血糖时,GIK不能发挥降低AMI死亡率的作用。提示高血糖有可能抑制了GIK对缺血心肌的保护作用。激活3-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B (PI3K/Akt)信号转导通路从而促进缺血心肌细胞存活,是GIK和胰岛素保护缺血/再灌注(I/R)心肌的关键机制。然而高糖可通过增加活性氧(ROS)产生,直接或间接地抑制Akt激活。那么,高血糖是否抑制在体I/R心肌PI3K/Akt信号转导,从而削弱GIK保护心肌作用,目前并不清楚。本课题旨在研究急性缺血期高血糖对在体I/R心肌损伤的影响,以及对GIK心肌保护作用的影响,并从信号转导角度探讨PI3K/Akt信号分子改变在高血糖致缺血性心肌损伤中的作用,以期初步阐明高血糖加重I/R心肌损伤和削弱GIK保护缺血心肌的机制。目的1.明确急性缺血期高血糖是否加重在体I/R心肌损伤。2.明确高血糖是否抑制GIK对在体I/R心肌的保护作用。3.初步探讨高血糖损伤缺血心肌以及抑制GIK心肌保护作用的机制。方法1.雄性SD大鼠,腹腔麻醉后,开胸选择性结扎冠状动脉左室支,制备心肌缺血/再灌注大鼠模型。缺血30 min,再灌注4 h或6 h,再灌注开始后封闭胸腔,恢复动物自主呼吸。2.微导管自右侧颈动脉插管至左心室,记录左室内压。分离股动脉并插管记录动脉压,分离颈静脉建立静脉通路。I/R术中通过八道生理记录仪持续记录大鼠心电图、心率、动脉压以及左室内压等血流动力学指标。3.在心肌I/R模型的基础上,经静脉输注高糖溶液建立缺血期急性高血糖大鼠模型。将SD大鼠随机分为8组,分别是:(1)假手术组;(2)生理盐水对照组;(3)高糖1组(HG1组); (4)高糖2组(HG2组);(5) GIK组; (6) GIK+HG组; (7) GIK +渥曼青霉素(wortmannin)组;(8) GIK+ HG +wortmannin组。4.分别于缺血前、缺血30 min、再灌注2 h和4 h由尾静脉取血,测血糖水平和血胰岛素水平。血糖检测应用葡萄糖氧化酶法,血浆胰岛素应用放免法测定。5.再灌注4h后由颈动脉取血2 ml,用分光光度法检测血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性。6.再灌注6h结束后,采用伊文蓝-TTC双染法测定心肌梗死范围(IS),IS以心脏梗死范围(INF)占缺血区面积(AAR)的百分比表示(INF/ AAR×100%)。7.再灌4 h结束后,取缺血区心肌组织,采用DAPI细胞核标记和末端脱氧核苷基转移酶介导的dUTP原位平端标记法(TUNEL)复染定性和定量检测心肌细胞凋亡指数(AI)。AI以TUNEL阳性细胞数占总细胞计数的百分比表示。8.采用Western Blot方法测定缺血心肌组织Akt,pAkt,GSK-3β,pGSK-3β蛋白含量,以检测Akt磷酸化水平及其活性。结果1.大鼠血糖水平和血浆胰岛素水平在心肌I/R过程中无显著变化。当经静脉输注高糖溶液时血糖水平和胰岛素水平均显著升高,建立了AMI合并急性高血糖动物模型。当再灌注期静脉输注GIK时,血浆胰岛素水平显著升高。2.与对照组相比, HG组再灌注2h和4h的左室内压力变化微分(±LVdP/dtmax)显著下降,而在GIK组显著升高。与GIK组相比,GIK+HG组再灌注4h的±LVdP/dtmax分别下降了11.4 %和10.1 %(P < 0.05)。提示缺血期急性高血糖不仅使心肌I/R后心功能恶化,而且阻断了GIK改善再灌注后心室功能恢复的作用。3.各实验组间总缺血范围(AAR/LV)无明显差异。再灌注期给予GIK可显著减少IS,而缺血期高血糖不仅扩大IS,而且抵消了GIK减轻IS的作用。有趣的是,HG和wortmannin对GIK保护作用的阻断程度相似。另外,同时给予HG和wortmannin,与单独应用wortmannin相比较,对GIK心肌保护作用的阻断程度亦无显著差异。4. CK和LDH活性反映心肌损伤程度。二者在GIK组显著降低,缺血期高血糖不仅显著增加CK和LDH活性,而且使GIK的心肌保护作用消失,CK和LDH活性分别升高了27.3%和25.1%(P < 0.05)。5.再灌注期给予GIK发挥显著的抗心肌细胞凋亡作用,缺血期高血糖则显著增加缺血心肌细胞凋亡。HG和wortmannin均可阻断GIK抗细胞凋亡作用,且阻断程度二者之间不存在差异。更重要的是,同时给予HG和wortmannin,HG并不进一步加重wortmannin对GIK抗心肌细胞凋亡作用的阻断程度,提示高血糖可能通过阻断GIK诱导的PI3K/Akt信号转导途径的激活而阻断GIK的抗细胞凋亡作用。6. GIK使缺血心肌的pAkt增加1.7倍,pGSK-3β增加2.3倍,而wortmannin几乎完全阻断GIK对Akt激活及其心肌保护作用,提示GIK通过PI3K/Akt途径保护缺血心肌。HG不仅抑制I/R心肌基础状态下的Akt磷酸化及其活性,而且阻断GIK诱导的Akt活化增加。当同时给予HG和wortmannin时,HG并未进一步加重wortmannin对GIK诱导Akt激活的阻断程度,提示高血糖阻断了GIK诱导的PI3K/Akt信号通路激活。结论1.缺血期急性高血糖不仅显著加重大鼠缺血/再灌注心肌损伤,增加缺血心肌对再灌注损伤的敏感性,而且几乎完全阻断GIK保护缺血心肌的作用。使心梗面积扩大,心肌酶谱升高,缺血心肌细胞凋亡增加和再灌注后左室功能减低。2.缺血期高血糖抑制缺血心肌基础状态的及GIK诱导的PI3K/Akt信号转导通路的激活,是高血糖加重缺血/再灌注心肌损伤和削弱GIK心肌保护作用的可能机制。