【摘 要】
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Pirin是一种非血红素金属蛋白,广泛存在于人体组织,结构高度保守。Pirin作为核蛋白通常起转录调节作用,也有报道表明其同源蛋白YhhW和hPirin具有催化降解槲皮素(槲皮素酶)的
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Pirin是一种非血红素金属蛋白,广泛存在于人体组织,结构高度保守。Pirin作为核蛋白通常起转录调节作用,也有报道表明其同源蛋白YhhW和hPirin具有催化降解槲皮素(槲皮素酶)的活性。然而,关于核转录因子Pirin及其同源蛋白的酶催化特性知之甚少。因此,研究Pirin的催化性能,比较其同源蛋白间的结构-功能关系,对进一步了解Pirin的催化机理及探索其确切功能具有重要意义。本文考察了Pirin同工酶的底物特异性,鉴定了底物黄酮醇的特征代谢产物,建立了表征酶催化的新分析方法并测定了酶动力学参数。主要内容如下:(1)Pirin同源蛋白的活性测试和比较:表达纯化了Pirin的同源蛋白,并对Pirin的同源蛋白的活性进行了测试和比较。结果表明,黄酮醇类天然产物可作为Pirin的特异性底物,拓展了底物范围。同时,基于Pirin同源蛋白(hPirin和Yhh W)在空间结构特别是金属结合位点上的不同变化,解释了其催化活性的显著差异。(2)hPirin催化氧化黄酮醇类底物的产物表征:基于hPirin催化黄酮醇氧化的特征产物,建立了hPirin催化黄酮醇氧化代谢的液相色谱分析方法。选取槲皮素、杨梅素、非瑟酮、山奈酚、桑色素为研究底物,采用体外药物代谢反应体系,结合质谱的多检测模式,对黄酮醇氧化代谢物进行了系统比较和鉴定,并同时推导了黄酮醇代谢物的质谱裂解规律。(3)hPirin催化黄酮醇类底物的动力学分析:运用新建立的hPirin催化黄酮醇氧化代谢物的液相色谱分析技术,对终止反应的试剂和初速度条件进行了优化,测定了槲皮素、山奈酚、非瑟酮的酶动力学参数。测得的三种底物的米氏常数K_m分别为10.86±0.47μM、9.36±0.61μM和12.52±0.58μM,结合该值比较了不同结构底物的相对活性。
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