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抑郁症是最常见的精神障碍之一,该疾病好发于儿童期及青春期,是世界各地致残的主要原因之一。越来越多的研究证实,众多精神神经系统疾病包括抑郁症等病因可以追溯至脑发育的关键阶段——出生前或出生后早期。最新动物实验和人群研究结果表明:除了营养不良、应激等因素外,脑发育期的感染等因素诱发的免疫刺激对抑郁症病因和病理生理也起了至关重要的作用。越来越多的研究表明,由感染性病原体或脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)等炎症因子诱导的早期炎症会导致成年期的抑郁和焦虑障碍。LPS已被广泛用于刺激炎症反应,包括在中枢神经系统中的炎症反应。神经再生是指神经干细胞分化为神经细胞,并逐渐迁移到功能区,进行可塑性变化,与其他神经元建立突触联系,产生完整的神经功能过程,也称成年期神经发生。成年哺乳动物大脑内的侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)和海马齿状回颗粒下区(subgranular zone,SGZ)终生存在神经再生的现象。成年海马神经发生被认为在情绪调节中起作用。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能中间神经元在控制抑郁状态中发挥重要作用,同时它是成年海马神经发生的关键参与者。此外,早期炎症一直被报道对成年海马神经发生有不利影响,但其分子机制尚未阐明。同时,大脑发育过程中,炎症刺激可激活星形胶质细胞,已经发现星形胶质细胞主要通过激活不同的信号通路来介导GABA抑制性突触的形成。研究目的:1.早期炎症对抑郁行为和海马神经发生的影响。2.GABA功能异常是否与早期炎症引起的成年海马神经发生障碍和抑郁行为有关。3.早期炎症诱发GABA功能异常的分子机制。实验方法:1.动物模型准备:孕17-18 d鼠饲养至生产,乳鼠从出生后第3天(postnatal day3,PND 3)-PND 5,在12:00-13:00之间,将幼崽从其母鼠身边取出约5 min,称重并每天腹腔注射50μg/kg LPS(溶于0.9%生理盐水)或1 ml/kg生理盐水。每次注射均通过一个30号不锈钢针头进行,该不锈钢针头通过聚乙烯管连接到10-μl Hamilton注射器上,造模小鼠饲养至2个月后开始实验。2.行为学检测:用旷场实验(Open field test,OFT)分析运动功能,用强迫游泳实验(Forced swimming test,FST)和悬尾实验(Tail suspension test,TST)分析抑郁样行为。3.激素测定:根据下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴昼夜节律的变化,于7:30-8:00处死一批LPS组和对照组小鼠,17:30-18:00处死另一批LPS组和对照组小鼠,血浆分离,-20°C保存,进行激素测定。采用放射免疫分析法检测血浆皮质酮和促肾上腺皮质激素(adreno-cortico-tropic-hormone,ACTH)浓度。4.海马神经再生检测:用5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,Brd U)腹腔注射标记有丝分裂S期的神经细胞。检测并计数Brd U注射后24 h和28 d的海马齿状回Brd U免疫阳性(Brd U~+)细胞。在Brd U注射后24 h进行Brd U免疫染色,在Brd U注射后28 d进行Brd U和神经元特异性核蛋白(Neuron-specific protein,Neu N)、Brd U和双皮层蛋白(Doublecirtin,DCX)双免疫荧光染色,分别分析神经干细胞的增殖和神经前体细胞的分化成熟。5.药物治疗:LPS组小鼠和对照组小鼠PND 66-72腹腔注射GABA_AR受体激动剂苯巴比妥(phenobarbital,PB)、PND 66-72侧脑室注射GABA_AR拮抗剂印防己毒素(picrotoxin,PTX)、PND 6-12腹腔注射Toll样受体4(Toll-likereceptors4,TLR4)受体拮抗剂TAK-242。6.用蛋白印迹法(Western Blot)检测海马GABA_AR、VGAT、谷氨酸脱羧酶67(glutamic acid decarboxylase 67,GAD67)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸受体激酶B(tyrosine receptor kinase B,Trk B)、磷酸化酪氨酸受体激酶B(phosphorylated tyrosine receptor kinase B,p-Trk B)、TLR4表达水平。7.用免疫荧光染色检测海马DG区离子钙接头蛋白-1(ionized calcium binding adapter molecule-1,Iba-1)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的形态及数量。实验结果:1.行为学实验结果显示,LPS组小鼠出现抑郁表型,但运动功能没有异常。2.激素测定结果显示,与对照组相比,LPS组小鼠的基础皮质酮释放量和峰值皮质酮释放量均显著增加,LPS组小鼠基础血浆ACTH升高,峰值ACTH明显升高。3.海马神经再生过程检测表明,与对照组小鼠相比,注射Brd U后24 h和28 d对照组小鼠和LPS组小鼠海马的Brd U细胞数量无明显差异,注射Brd U 28 d后LPS组小鼠海马的Brd U~+/Neu N~+细胞数量明显降低,Brd U~+/DCX~+细胞数量明显升高,提示LPS导致海马新生神经元成熟障碍。4.蛋白印迹结果显示,LPS组小鼠GABA_AR表达与对照组相比明显降低,VGAT、GAD67表达水平无明显改变。说明LPS给药损害了成年小鼠海马中GABA能系统。5.连续7 d注射PTX和PB后,用免疫荧光染色方法检测海马神经再生过程,结果显示PB可增加LPS组小鼠Brd U~+/Neu N~+细胞数量而对对照组小鼠无影响;而PTX减少了对照组小鼠中的Brd U~+/Neu N~+细胞数量但对LPS组小鼠无影响。表明GABA_AR的下调参与了海马新生神经元成熟的障碍。6.免疫荧光染色结果显示,对照组小鼠和LPS组小鼠Iba-1形态和数量均无明显改变,LPS组小鼠GFAP形态改变且数量较对照组明显升高,同时LPS组小鼠TLR4蛋白表达水平明显升高,提示LPS特异性地激活星形胶质细胞。7.蛋白印迹结果显示,与对照组小鼠相比,LPS组小鼠BDNF、p-Trk B蛋白表达水平明显降低,Trk B蛋白表达水平无明显改变,TAK-242可以改善LPS组小鼠BDNF和p-Trk B水平的降低,同时改善GABA_AR的下调情况,此外LPS组小鼠成熟的新生神经元数量明显增多,LPS组小鼠的抑郁样行为也明显减轻。结论:1.早期炎症导致小鼠出现海马神经再生障碍和抑郁行为。2.早期炎症诱发的海马神经再生障碍和抑郁行为与海马GABA_AR表达减少有关。3.早期炎症通过激活星形胶质细胞,下调BDNF-Trk B信号通路,引起GABA_AR表达减少。