论文部分内容阅读
伴随着近期的微流控技术的发展，我们可以在芯片上实现并行的实验条件、对细菌所处的微环境进行可编程的控制、长时间的观测单细菌尺度上的动态变化，使得我们在细菌耐药性这个老问题上可以实现更加系统和定量的研究。本论文将围绕基于微流控芯片观测的大肠杆菌单层实时表型变化、相关数据分析以及结合数学模型推出的抗药性机制为主要内容进行完成。 首先，我们设计了两类微流控芯片结构。第一类芯片设计为一种多孔大肠杆菌单细胞观测芯片，它虽然有操作快捷方便、易于加工制作等优点，但由于无法调控芯片内微环境，只适用于快速定性的观测细菌对药物的响应行为。为了研究抗药性动力学过程，改进的第二类芯片中，不仅可以把细菌长时间限制在单层程度来观测表型变化，而且连接注射泵并结合程序操作，可编程控制芯片内微环境，因此我们采用第二类芯片设计用于定量的单细胞尺度上的响应动力学研究。 我们在实验中选用了插入了CTX-M质粒的耐药性菌株以及对头孢类药物敏感的细菌菌株做为对比的研究对象，在第二类微流控芯片中，实现了单层实时观察正常培养和加入不同抗生素浓度后的每个细菌的表型变化过程，得到了不同抗生素浓度下所有包括细胞长度、蛋白表达、生长率等的数据。并通过对这些数据的统计与分析，建立生物数学模型来解释大肠杆菌耐药性机制。实验结果结合基于抗药机制模型的模拟结果分析，我们有下列新的发现: (1)耐药菌株对应出现丝状以及死亡的浓度点远大于敏感菌株，且耐药菌株对应的这两个浓度点的比值也与敏感菌株有明显不同;(2)无论是抗药株还是敏感株，菌群中生长速率慢的菌有更强的耐药性，生长速率快的菌耐药能力差，细胞壁健康状态差即容易死亡;(3)加药一段时间后，抗药株中会出现生长速率回升即药物适应行为，但是在敏感株中我们没有发现这种现象。 我们发现抗生素压力下细菌健康状态与生长速率有关系。并且虽然在抗生素压力下两种菌株的健康状态都在下降，但是内部抗药机制存在明显差别。我们通过抗药机制模型分析和预测了大肠杆菌抗药株与敏感株内部的抗药机制，最后介绍了基于流式细胞仪分选研究休眠态耐药性菌株的实验设计以及未来工作展望。