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背景介绍卵巢癌是严重危害女性身心健康的生殖系统肿瘤之一,其发病率相比其他的妇科恶性肿瘤（如宫颈癌、子宫内膜癌）略低。据数据统计显示,全球每年新增卵巢癌发病人数超过52万人,仅在我国每年卵巢癌新增患病人数即超过13万人。并且卵巢癌还是全球范围内致死率较高的恶性肿瘤之一,是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤,近些年来,卵巢癌的发病率与死亡率仍呈不断上升趋势。卵巢癌恶性程度很高,在发病早期并无典型的临床症状,术前也不易鉴别肿瘤的恶性程度与组织类型,因而在确诊时已往往处于晚期,错失最佳的治疗时机。同时由于卵巢癌具有易扩散、易腹腔转移、易复发、耐药率高等特点,卵巢癌患者的总体预后极差,尤其是III-IV期患者,5年生存率仅有25%～30%左右。在过去的20年,基于肿瘤根治手术、肿瘤减灭术治疗、多项辅助药物联合化疗和放射治疗等技术在临床上的应用为患者带来了新的希望,然而,总体存活率仍然较低,且化疗产生的耐药性,亦给患者带来严重的毒、副作用。因此,针对卵巢癌的恶性转移、复发、耐药等分子机制的深入研究,探索早期检测筛选的方法和更有效的晚期治疗策略,仍是当前基础肿瘤学研究的热点。近年来,随着分子生物学的发展,已发现抑癌基因突变或失活（P53、BRCA、ARID1A）、癌基因的异常激活（Ras、Her2、c-fms）以及表观遗传学的改变（甲基化水平、组蛋白修饰）与卵巢癌的恶性临床表型,肿瘤细胞的远处转移以及复发等恶性生物学行为密切相关。富含脯氨酸蛋白（Proline-rich Protein 11,PRR11）基因是新近发现的一种候选癌基因,PRR11作用靶标范围极其广泛,包括膜蛋白受体、粘附分子,生长因子和转录因子等,在肿瘤发生及恶性进展中发挥着重要作用。PRR11对恶性肿瘤影响的研究最早始于肺癌,有报道显示PRR11参与调控肿瘤细胞周期进展。靶向敲低PRR11表达后可引起核糖核苷酸还原酶RRM1和RRM2表达下调,DNA合成速率降低,导致细胞周期阻滞于S期,进而促使细胞增殖能力显著降低。PRR11广泛地表达于消化道恶性肿瘤组织标本中,表达率由高到低依次为食管鳞癌,胃癌,十二指肠癌,结直肠癌,肝癌,是判断患者预后的重要指标。此外,PRR11还可通过调节胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤上皮细胞的间质转型,促进肿瘤细胞的局部浸润和远处转移。然而,在国内外文献中,尚未发现PRR11在卵巢癌的表达以及在卵巢癌中的生物学功能的相关研究报道,为此,在本课题中,通过临床取材分别获得51例卵巢癌组织以及51例卵巢正常上皮细胞标本,在组织水平上,分析PRR11的表达与分布,并探讨其与患者临床病理参数之间的关系;此外,进一步在体外实验中对PRR11在卵巢癌发生发展中的作用及机制进行初步的探索,为卵巢癌临床治疗提供新思路和新靶点。第一部分PRR11在卵巢癌组织中的表达及其临床意义目的:本部分旨在探讨PRR11在卵巢癌临床样本中的表达及分布,并分析PRR11表达与卵巢癌临床病理参数的相关性,初步探讨PRR11在卵巢癌疾病进展中的意义。方法:1.分别采用Real-time PCR、蛋白免疫印迹检测临床收集的51例卵巢癌组织和51例正常卵巢上皮细胞中PRR11 m RNA与蛋白水平的变化;2.应用免疫组织化学法检测PRR11蛋白在卵巢癌组织中的表达及定位,根据PRR11蛋白表达强度分组,进一步分析其与患者临床特征（年龄、组织学分级、淋巴结转移、FIGO分期和组织学类型等）的相关性。3.使用Kmplotter分析PRR11表达与卵巢癌患者预后的相关性。结果:1.与正常的卵巢上皮细胞标本相比较,卵巢癌组织中PRR11在m RNA和蛋白水平呈高表达状态;2.在卵巢癌细胞中,PRR11蛋白主要定位于细胞浆中;临床病例资料分析发现PRR11表达高低与卵巢癌FIGO分期（P=0.026）、淋巴结转移（P=0.029）之间呈正相关,与患者年龄（P=0.649）、组织学分级（P=0.803）和组织学类型（P=0.869）无相关性。3.PRR11高表达卵巢癌患者的总生存期明显低于低表达组患者。结论:卵巢癌组织中高表达的PRR11水平与患者临床恶性表型（FIGO分期,淋巴结转移）呈正相关,高表达的PRR11卵巢癌患者具有较短的生存期,预后越差,PRR11可能作为一个不良预后指标,参与了卵巢癌的疾病进展。第二部分PRR11在卵巢癌细胞中的表达及对卵巢癌细胞增殖能力的影响目的:本部分旨在分析敲低或过表达PRR11基因后对卵巢癌细胞增殖能力的影响及可能机制。方法:1.采用蛋白免疫印迹法分别检测人正常卵巢上皮细胞I0SE80、人卵巢癌细胞系Caov3、SKOV3、OVCAR3和HO-8910中PRR11蛋白的表达。2.设计、合成靶向敲低PRR11的小干扰RNA,采用脂质体LipofectamineTMRNAIMAX转染入人卵巢癌HO-8910细胞中,分别采用Real-time PCR和蛋白免疫印迹法观察PRR11在m RNA和蛋白水平的干扰效率。3.体外构建PRR11过表达重组载体,采用脂质体LipofectamineTM 2000转染入人卵巢癌Caov3细胞中,分别采用Real-time PCR和蛋白免疫印迹观察PRR11 m RNA和蛋白水平的过表达效率。4.分别采用CCK-8、克隆形成实验分析敲低PRR11表达后对卵巢癌细胞HO-8910增殖及克隆形成能力的影响。5.分别采用CCK-8、克隆形成实验过表达PRR11基因后对卵巢癌Caov3细胞增殖及克隆形成能力的影响。6.蛋白免疫印迹法检测沉默或过表达PRR11对细胞增殖相关基因c-myc、细胞周期蛋白cyclin D1表达的影响。结果:1.与人正常卵巢上皮细胞I0SE80相比,PRR11在四种卵巢癌细胞中均呈高表达趋势;其中,PRR11蛋白表达水平在Caov3细胞系中最低,在HO-8910细胞系中最高。2.RNAi敲低PRR11基因表达后,显著抑制HO-8910细胞的增殖及克隆形成能力。3.过表达PRR11基因可显著促进Caov3细胞增殖及克隆形成能力。4.RNAi沉默PRR11基因表达后,HO-8910细胞中增殖相关基因c-myc、细胞周期蛋白cyclin D1蛋白表达明显降低。5.过表达PRR11基因后,Caov3细胞中增殖相关基因c-myc、细胞周期蛋白cyclin D1蛋白表达明显增加。结论:PRR11在卵巢癌细胞中呈高表达趋势,PRR11可能通过正调控增殖相关蛋白c-myc、cyclin D1表达促进卵巢癌细胞的恶性增殖。第三部分PRR11对卵巢癌细胞侵袭及迁移能力的影响目的:本部分旨在探讨敲低或过表达PRR11基因对卵巢癌细胞侵袭及迁移能力的影响及可能机制。方法:1.分别采用Transwell侵袭与迁移实验分析敲低PRR11表达后对卵巢癌细胞HO-8910侵袭与迁移能力的影响。2.分别采用Transwell侵袭与迁移实验分析过表达PRR11基因后,对卵巢癌Caov3细胞侵袭与迁移能力的影响。3.蛋白免疫印迹法检测敲低或过表达PRR11基因,对金属基质蛋白酶MMP-2、金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-2表达的影响。结果:1.RNAi敲低PRR11基因表达后,HO-8910细胞的侵袭、迁移能力显著降低,金属基质蛋白酶MMP2表达明显下调、金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-2表达升高。2.过表达PRR11基因后,Caov3细胞的侵袭、迁移能力显著增加,金属基质蛋白酶MMP2表达明显上调、金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-2表达降低。结论:在卵巢癌中,高表达的PRR11可能通过调节MMP2/TIMP-2比率,促进卵巢癌细胞的侵袭迁移能力。第四部分PRR11调控卵巢癌细胞生物学行为的机制研究目的:本部分旨在分析PRR11调控卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移能力变化的分子机制。方法:1.蛋白免疫印迹法检测沉默PRR11后,HO-8910细胞中Akt、p-Akt、细胞总β-catenin和细胞核内β-catenin表达水平变化。2.Caov3细胞转染PRR11过表达重组载体,并添加PI3K特异性抑制剂LY294002后,蛋白免疫印迹检测Caov3细胞中Akt、p-Akt、细胞总β-catenin和细胞核内β-catenin的表达变化,并分别采用CCK8法、克隆形成实验及Transwell实验检测Caov3细胞增殖、克隆形成及侵袭迁移能力的变化。结果:1.RNAi敲低PRR11基因表达后,HO-8910细胞中Akt活性明显降低,细胞总β-catenin和细胞核β-catenin表达明显减少。2.过表达PRR11基因后,Caov3细胞中Akt活性明显增加,细胞总β-catenin表达增加,β-catenin细胞核转入增加,细胞增殖、侵袭迁移能力明显增加;当加入抑制剂LY294002后,Akt活性明显降低,细胞总β-catenin表达减少,细胞核β-catenin转入减少,Caov3细胞增殖、侵袭迁移能力受到抑制。结论:在卵巢癌中高表达的PRR11可能通过激活PI3K/Akt信号,促进β-catenin核转位继而调控肿瘤细胞的恶性增殖、侵袭迁移能力。