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利什曼原虫过氧化物酶(LmP)是一种以细胞色素C为底物需消耗H2O2的一种血红素过氧化物酶。本课题从来源于Leishmania major strain Friedlin的LmP基因片段出发,构建了多个含有LmP基因片段的表达载体。 首先是通过分子生物学操作,构建了分别含有类弹性蛋白ELP标签和小泛素相关修饰蛋白SUMO标签的融合蛋白表达载体,探究了其性质的变化。通过Ni-NTA金属螯合层析法对含有组氨酸标签的三种蛋白完成了纯化工作,到达了理想的纯度,含ELP标签的蛋白用ITC法纯化两到三次便可达到理想效果。再对蛋白进行了圆二色谱和荧光光谱的表征,在加入H2O2后,结构变化最小的是加了ELP标签的蛋白。再结合荧光光谱测出的Stern-Volmer方程KSV数值,用数字直接证明加了ELP标签的LmP蛋白结构变化最小,说明ELP标签对LmP蛋白构象有一定的稳定作用。SUMO标签的作用还是它的本职功能,助溶。同样条件表达纯化的LmP-SUMO和LmP,前者浓度是后者10倍,SUMO标签增溶效果强大。改造后的酶活并没有受到负面影响,甚至催化速率有所提高。 高效多酶催化体系在生物领域被广泛研究,深入研究及完善多酶催化体系具有很大的发展潜力。所以本文通过内含肽介导融合LmP和D-氨基酸氧化酶,建立LmP-DAAO复合酶催化体系。实验证明,进一步提高了DAAO的酶活,DAAO可用于生产头孢菌素类抗生素,这对DAAO在工业上的应用中具有一定的参考意义。最后,在体外直接混合LmP和5-羟甲基糠醛氧化酶反应体系,提高了产物2,5-呋喃二甲酸(FDCA)的产率,FDCA被称作是最具有潜力的生物基化合物之一,在工业生产中应用广泛。 综上所述,经ELP修饰后可提高LmP构象的稳定性,在LmPC端添加SUMO标签可显著提高蛋白可溶性,构建LmP-DAAO双酶催化体系可提高DAAO催化速率,LmP和5-羟甲基糠醛氧化酶的连续反应提高了目的产物2,5-呋喃二甲酸FDCA的产率,对工业应用有参考意义。