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目的:先天性肛门直肠畸形(Anorectal malformations,ARMs)是最常见的小儿消化道畸形,同时也是世界卫生组织常规监测的先天畸形之一,其发病率为1/5000～1/1500,居消化道畸形首位。研究至今,ARMs的病因仍不清晰,且病理类型及改变繁多而复杂。虽然手术方式不断改进,总病死率及手术死亡率显著下降,但是国内外学者随访发现,部分患儿术后仍存在不同程度的排便功能障碍,对患儿的生活质量及心理健康造成不同程度的影响,给患儿家庭和社会带来沉重的医疗负担和经济压力。便秘、便失禁等不良预后与畸形类型及伴发畸形,如盆底肌发育异常、盆底肌的支配神经发育异常和骶尾椎发育不良等发育缺陷密切相关。在诸多因素中,盆底横纹肌复合体(Striated Muscle Complex,SMC),是控制排便的关键因素之一,SMC中的肌肉神经发育异常是影响AMRs患儿预后的重要原因之一。相关前期研究已证实,ARMs患儿及实验动物模型中均存在着不同程度的SMC发育异常。表现为肌纤维发育异常、肌梭发育异常与运动终板发育异常。胚胎期SMC的发育过程较为复杂,是诸多环境与遗传因素共同作用的结果。参与其中的分子、通路及通路间相互作用等至今尚不明晰。而在ARMs患儿的SMC组织中不仅存在着肌纤维走行紊乱等病理特征,还存在着肌梭密度降低、运动终板密度降低的异常发育表现。至今为止,针对ARMs中SMC的神经发育异常的研究甚少,其中的发育机制也尚不明晰。因此,本研究利用高通量测序技术,在转录组水平上对ARMs胚胎SMC中异常表达的基因进行筛查,探讨其肌纤维与神经突触发育异常的可能机制。Wnt(Wingless-type MMTV integration site family members)信号通路与骨骼肌的发育密切相关,参与调控骨骼肌生长、发育、再生和疾病的发生。亦有研究表明,Wnt信号通路与神经肌肉接头(Neuromuscular junction,NMJ)的发育相关,而NMJ的结构与功能异常可引起重症肌无力等神经肌肉系统障碍疾病。在不同组织的发育中,Wnt信号通路与其他的信号通路存在交互作用,其中包括骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)、Sonic hedgehog(Shh)和Notch信号通路。本课题组前期研究对Wnt信号通路的差异表达有所研究,但是经典Wnt通路及非经典信号通路中信号转导关键分子及其相互作用通路中关键分子的研究甚少。其下游效应分子的表达情况亦不明晰。Wnt信号通路在ARMs的SMC组织发育过程中究竟通过何种方式起作用,依旧不明朗。同时,BMPs等通路与Wnt通路的交互作用,在不同组织的发育过程中,表达情况以及参与机制亦有不同,而在ARMs直肠组织的发育过程中,上述通路存在差异表达,但是,是否参与中SMC的异常发育过程,亦不明晰。非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)通过多种机制调控基因的表达,在胚胎发育中发挥着非常重要的作用。在心脏发育,神经系统发育及肌肉发育中,ncRNA都起到重要作用。而在ARMs的盆底肌发育过程中,ncRNA的研究尚属空白,鉴于ncRNA的作用,相关研究亟待开展。肌肉与神经的修复较为困难,尤其是肌肉神经接头的修复,需经历较长的时程与较为复杂的生物学过程。肌源性干细胞(Muscle-derived stem cells,MDSCs)是肌肉来源的,具有多能性的干细胞,不同于肌卫星细胞,MDSCs能打破胚层限制,分化为不同胚层的细胞,例如神经细胞、肌细胞、胰岛细胞、成骨细胞等。因其强大的增殖能力和多向分化潜能,MDSCs被认为是一种颇具前景的基因载体,并被临床医学和组织工程学广泛应用。成肌细胞系是具有体外分化为肌管能力的专能干细胞,不同于MDSCs这类多能干细胞,成肌细胞系只能分化为肌纤维,但其增殖能力强大而且分化方向确定,因而也被认为是适合肌组织修复的干细胞类型。综上,本研究中采用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸的Wistar大鼠肛门直肠动物模型。运用转录组测序技术(RNA Sequencing,RNA-Seq)检测对照组与肛门直肠畸形组中差异表达的mRNA、lncRNA和circRNA,并通过富集分析和共表达网络构建等分析方法,来筛查与ARMs胎鼠SMC发育异常相关的分子及信号通路,并探索Wnt信号通路及其相互作用通路中关键分子的表达差异。利用报告基因实验验证lncRNA—miRNA—mRNA间的相互结合,同时体外培养MDSCs和成肌细胞系,鉴定后移植到ARMs胎鼠的SMC区域,观察细胞的定植、存活和分化情况,探索肌源性干细胞移植治疗发育异常的盆底横纹肌复合体的可行性。研究方法:1、动物模型制备及标本收集。Wistar大鼠,体重230～280 g,约12周龄,由辽宁长生生物公司提供,雌雄鼠以5:1比例合笼,次日清晨阴道涂片,显微镜下观察涂片,发现其上有精子者,标记为孕0天(Embryonic day 0,E0),于E10制作ARMs大鼠动物模型,灌胃喂入以生理盐水溶解稀释的1%ETU(125 mg/kg)致畸,对照组给予等量的生理盐水。E19时,异氟烷吸入麻醉孕鼠,然后剖宫取胎收集标本组织,后续用于切片进行免疫组织化学染色的标本,经过4%多聚甲醛溶液固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明和石蜡包埋过程,于常温条件保存;后续进行Western blot和RT-qPCR(Quantificational reverse transcriptase-polymerase)实验的标本,在解剖显微镜下收集SMC组织,RNA保护液浸润后,深冻冰箱冻存。2、转录组测序筛査ARMs胎鼠与正常胎鼠SMC组织中差异表达的基因。在E19时收集对照组及ARMs组SMC组织,进行高通量测序实验(该项实验由北京博奥晶典生物技术有限公司提供技术服务与支持)。检测E19时对照组和ARMs组中可能存在的差异表达的编码RNA及非编码RNA,利用GO及Pathway分析对数据进行解读与归类,并推测差异mRNA所编码的蛋白间的相互作用,在差异表达的基因与ncRNA中,选取与肌肉发育和神经发育相关的部分基因以及ncRNA,利用RT-qPCR技术对它们的差异表达情况进行验证。3、RT-qPCR技术。提取总RNA后,利用紫外分光光度计检测样品质量与浓度,各样品调整到同一浓度水平,去除基因组DNA后逆转录合成cDNA,各步骤体系按照试剂盒推荐的方法配制,对mRNA、lncRNA和circRNA进行RT-qPCR检测。4、Western blot技术。提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,各样品蛋白浓度调整到同一水平,配胶体系按照试剂盒说明书配制,电泳转印后封闭,一抗按照说明书推荐比例稀释,4℃孵育过夜,二抗常温孵育2 h,滴加发光液,成像拍照。5、免疫组化技术。石蜡切片逐步脱蜡脱苯至水,抗原修复后阻断内源性过氧化物酶,正常非免疫血清封闭,一抗按照说明书推荐比例稀释,4℃孵育过夜,二抗常温孵育30 min,DAB显色,苏木精复染,梯度酒精脱水,中性树胶封片。6、双萤光素酶报告基因实验:利用TargetScan等网站预测结合位点,依据网站提供的序列进行质粒构建并在合成后进行测序和抽提,制备感受态细胞,按组别加入对应的质粒、miRNA和转染试剂到293T细胞中,共转染48 h后检测Luciferase活性,取萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性的比值进行数据分析。7、子宫内MDSCs及成肌细胞系细胞移植修复盆底横纹肌复合体。应用两步消化法及差速贴壁法,从新生雄鼠后肢提取并分离得到MDSCs,体外培养增殖,应用免疫荧光染色法对MDSCs进行鉴定,利用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(Ad-eGFP)转染MDSCs后,胰酶消化后制成细胞悬液,后续移植入ARMs胎鼠的SMC区域,观察移植后MDSCs在ARMs胎鼠体内SMC区域存活及分化情况。同时,对成肌细胞系进行培养,应用免疫荧光染色法对细胞系进行鉴定,利用Ad-eGFP转染细胞系后,胰酶消化制备成细胞悬液,后续移植入ARMs胎鼠的SMC区域,观察移植后成肌细胞在ARMs胎鼠体内SMC区域存活及分化情况。8、宫内移植干细胞手术及ARMs胎鼠出生后显微造瘘手术。宫内移植干细胞手术:ETU致畸的孕鼠在E19时异氟烷吸入麻醉,切开一侧的子宫角,用浸过温生理盐水的湿纱布覆盖子宫。借助冷光源透过子宫壁找到短尾或无尾的胎鼠,在子宫壁预置荷包缝合线,荷包中心做一个小切口,打开子宫壁及羊膜囊,清晰暴露盆底区域。用微量注射玻璃针将提前制备好的MDSCs或成肌细胞悬液注射到ARMs胎鼠肛凹两侧SMC区域。显微注射完成后将胎鼠轻推回子宫内结扎荷包缝合。4-0外科尼龙线缝合腹壁肌层和皮肤,逐层关腹。记录手术鼠的位置,方便取胎时辨认。手术后对孕鼠进行灯烤复温,待麻醉苏醒后,将其放回笼中继续饲养。E22时,对手术孕鼠行剖宫产取出胎鼠,干燥棉签清理口鼻粘液,轻微按压心脏,直至新生鼠可自主呼吸,肤色开始变红。畸形胎鼠出生成活后,对其进行低温麻醉,麻醉成功后右侧卧位,取头低脚高位;四肢胶带固定,剪开皮肤和腹肌进入腹腔内;寻找直肠或结肠,结扎远端直肠,近端造瘘;尽可能游离肠道,保证造瘘肠道无张力,无回缩,可轻度脱出于造瘘口;术中注意操作轻柔以保护肠管及脏器,避免器械划伤重要血管;肌层与皮肤间断缝合,缝合过程避免牵拉或划破肌层;术后生理盐水擦净血迹,加热恒温板复温,埋于旧垫料中,归于母鼠。每日扩瘘两次,早晚各一次,于手术显微镜下,显微器械去除造瘘口分泌物,直至可见黄色粪便,注意不要划破皮肤及肠道,生理盐水冲洗,擦净后归还母鼠。9、应用SPSS 24.0统计软件进行统计学分析,正常组与ARMs组差异的比较,先判断数据是否符合正态分布,若呈正态分布或近似正态分布则采用独立样本t检验,相关性采用Pearson检验,所有的实验数据均以均值±标准差来表示,统计值p<0.05表示差异有统计学意义。结果:1、高通量测序筛查,筛查条件为│log2FC│≥1且p-value<0.05。log2FC即差异表达倍数再取以2为底的对数,log2FC≥1即为上调的差异基因,log2FC≤-1为下调的差异基因。ARMs组与对照组相比,表达上调的mRNA 886个,下调的mRNA 522个;上调的lncRNA 218个,下调lncRNA 254个;上调circRNA 191个,下调circRNA130个。通过分类及富集分析,对数据进行初步归类与筛选,利用RT-qPCR技术对差异表达的部分基因以及ncRNA进行验证,主要选择与神经发育和骨骼肌发育相关的基因以及ncRNA,证实测序结果中m RNA准确率为86.67%,lncRNA准确率为60.00%,circRNA准确率为77.78%2、利用RT-qPCR、Western blot及免疫组织化学染色技术对WNT7A、β-Catenin和BMP2的mRNA及蛋白的表达水平进行验证,同时利用Western blot检测Phospho-β-Catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白的表达水平;发现ARMs胎鼠SMC中WNT7A、β-catenin和BMP2表达明显升高,与测序结果一致,同时ARMs胎鼠SMC中Phospho-β-Catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白的表达水平亦明显升高。3、利用靶基因预测软件miRanda对高通量测序结果中存在差异表达的lncRNA和mRNA的靶向miRNA进行预测,依据ceRNA机制,筛选出如下可能存在靶向调控关系的3个分子对:TCONS＿00051629—Syt7;TCONS＿00051629—Retn;TCONS＿00028283—Dkk3。在ARMs的SMC组织中,利用RT-qPCR、Western blot和免疫组织化学染色技术进行表达水平的验证,证实如上3个分子对中,二者的差异表达趋势相同。利用TargetScan等软件进一步预测能与lncRNA及其靶向mRNA相互结合的miRNA以及结合位点。通过取交集的方法筛选miRNA,构建质粒并利用双萤光素酶报告基因实验,证实TCONS＿00051629—rno-miR-326-3p—Retn、TCONS＿00051629—rno-miR-330-5p—Retn、TCONS＿00028283—rno-miR-193a-5p—Dkk3、rno-miR-328a-3p—Dkk3和rno-miR-3584-5p—Dkk3之间存在结合位点并起到调控作用。4、提取的肌源性干细胞经体外培养24 h后PAX7蛋白免疫荧光染色呈阳性,48h后Desmin蛋白免疫荧光染色呈阳性。MDSCs经Ad-eGFP转染后,荧光显微镜下观察出现绿色荧光,原位注射移植到ARMs胎鼠SMC区域,移植后MDSCs在ARMs胎鼠体内存活,并表达成熟肌细胞特异性蛋白MYH。成肌细胞系细胞体外培养并经免疫荧光染色实验证实,PAX7蛋白和Desmin蛋白表达阳性。成肌细胞系经Ad-eGFP转染后,荧光显微镜下观察出现绿色荧光,移植到ARMs胎鼠SMC区域,可在ARMs胎鼠体内存活,并表达成熟肌细胞特异性标记蛋白MYH。结论:1、ARMs的SMC组织在转录组层面存在明显异常改变,包括1408个mRNA、472个lncRNA和321个circRNA异常上调或下调,主要富集在与神经肌肉的发育与疾病相关的通路中。2、WNT7A、β-catenin和BMP2的mRNA及蛋白的表达水平在ARMs胎鼠SMC中明显升高;Phospho-β-Catenin、c-Myc和Cyclin D1蛋白的表达水平亦明显升高。3、TCONS＿00051629—Syt7;TCONS＿00051629—Retn;TCONS＿00028283—Dkk3中的lncRNA、mRNA和蛋白在ARMs的SMC中存在同向表达趋势,TCONS＿00051629可通过与rno-miR-326-3p或rno-miR-330-5p竞争性结合调控Retn的表达;TCONS＿00028283可通过与rno-miR-193a-5p竞争性结合调控Dkk3的表达;同时rno-miR-328a-3p—Dkk3和rno-miR-3584-5p—Dkk3间存在调控关系。4、肌源性干细胞和成肌细胞系在移植至ARMs胎鼠盆底SMC区域后,能定植存活并分化成为成熟的肌细胞。