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生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer,BRET)是一种发生在生物发光蛋白如荧光素酶(供体)和荧光物质(受体)间的非辐射能量转移。由于BRET不需外源激发,背景低,灵敏度高,其作为微小距离的光学尺,已经在蛋白相互作用,活体影像,核酸分析,蛋白酶检测及高通量筛选等生物分析相关领域得到了广泛的应用。但BRET分析还存在一些实际问题,例如,经典BRET技术使用的供体Renilla荧光素酶(Rluc)量子产率较低,受体多为绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)突变体,体系发射光多处于红光区以外,不利于消除细胞内分析时的荧光背景。同时有研究发现了:Rluc/GFPs体系在不同环境下的能量转移效率不同这一现象,有可能对复杂环境下的BRET结果产生不利的影响或者错误的解读,但并未做深入的研究和科学解释。
本研究主要针对目前BRET体系应用中的问题和不足,采用近年来最引人瞩目的具有高亮度,低分子量人源化的Gaussia荧光素酶(hGluc)构建新的BRET系统。并在此基础上,研究环境对BRET体系的影响作用,发展了一种基于BRET技术的高灵敏,低成本的蛋白酶检测新体系;同时构建具有能红外发光的BRET体系。针对以上目标,本研究开展了以下的工作:
1.将hGluc与增强型黄色荧光蛋白EYFP融合表达,构建蛋白酶检测传感器,实验研究了环境因素对hGluc/EYFP的影响。研究发现一些常用缓冲液的成分,pH及二价阳离子对hGluc/EYFP体系的BRET比值具有显著的影响,含高浓度咪唑成分的溶液(溶液E)被发现能最大程度的提高BRET比值。
2.在以上研究基础上,提出了一种能同时满足蛋白酶反应以及BRET效率的增强检测方法。通过在hGluc和EYFP之间的连接肽分别插入A型肉毒毒素轻链蛋白(BoNT/A Lc,Lc)和肠激酶的识别序列分别构建了Lc和肠激酶特异的检测探针。发现引入溶液E(520 mM咪唑)能够使酶活反应体系和信号检测体系同时达到最佳,尤其是当两个体系不一致,前者会严重影响后者时适用。使得检测灵敏度提高22倍。
3.将hGluc与tdTomato融合表达,构建了谱分辨率更大且能发红外荧光的BRET体系,基于该BRET系统的肠激酶蛋白酶检测传感器对环境较不敏感,相比hGluc/EYFP探针,hGluc/tdTomato探针的检测限低30多倍,说明谱分辨率更大的hGluc/tdTbmato BRET体系具有更好的检测表现。
通过以上的研究,本论文证明了hGluc是一种良好的BRET供体,具有替代经典供体Rluc的巨大潜力,所提出的增强缓冲液策略为当BRET体系对环境敏感时,平衡反应与BRET检测两种最佳体系的关系提供了新的参考手段,所构建的红色BRET体系具有体内应用的巨大潜力;这些发现为更好地发展BRET生物分析方法提供了新的方法和手段。