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肠出血性大肠杆菌(EHEC)是近年来新发现的一种食源性细菌,O157∶H7是其中主要的血清型。EHEC能感染人和动物,引起出血性肠炎(HC)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)以及出血性尿毒综合症(HUS)等严重的疾病。在老人和儿童,出血性大肠杆菌感染死亡率高达30%,而HUS的病死率甚至可高达50%以上。目前,对O157∶H7感染尚缺乏有效的防治方法,只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗。但研究证明大多数抗生素可促使或诱导O157∶H7大肠杆菌释放Vero毒素,诱发溶血性尿毒综合症。控制由大肠杆菌O157∶H7引起的食物中毒或感染的暴发与流行,准确快速检测大肠杆菌O157∶H7是关键。对该病原体的鉴定有许多手段,但是按照国际标准需要对该病原体做生化鉴定反应、血清学试验、毒力因子鉴定等实验后才能确认。因其耗时较长,不能满足临床快速诊断的要求。为了建立E.coli O157∶H7快速检测方法,本试验利用细胞融合技术,制备抗O157∶H7单克隆抗体并对其特异性进行鉴定,为检测用胶体金试纸条的制备打下良好的基础。1、单抗的制备:以全菌为抗原,免疫8周龄BALB/c小鼠,每次免疫间隔时间3周。加强免疫3天后,经PEG法融合,用建立的间接ELISA方法进行筛选。对初步鉴定为阳性的细胞克隆,采用有限稀释法进行3次亚克隆后,得到3株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞1E7、7D11和3A11。2、单抗的鉴定:三株单抗1E7、7D11和3A11细胞上清的效价分别为1:2 560,1:2 560,1:1 280。纯化的腹水经ELISA测定效价分别为1:6.4×10~6、1:1.2×10~7、1:3.2×10~4。其亚类分别为IgG1亚类,IgG2a和IgM。对3株单抗的染色体计数结果显示: 1E7的染平均数为104条,7D11的染色体平均数为102,3A11染色体平均数为98条。选取1E7和7D11做叠加试验和单抗的特异性试验。叠加试验结果表明2株单抗分别针对不同的抗原位点。单抗的特异性试验结果显示,2株单抗与人型结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等均不发生交叉反应。3、单抗的纯化:纯化后1E7和7D11单克隆抗体SDS-PAGE电泳结果显示,1E7抗体的重链和轻链的分子量分别为45KD和20KD;1E7抗体的重链和轻链的分子量分别为45KD和18KD。以纯化后的单抗做亲和力测试,1E7和7D11的亲和常数分别为1.4×10~6,2.8×10~6。