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研究背景及意义鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)属机会致病菌,在环境中普遍存在,于正常人体亦有定植,但条件适宜时可在肺部、血液等人体组织造成严重感染,尤其见于免疫力受损的ICU患者。有别于多数革兰阴性菌,鲍曼不动杆菌具有较强的粘附能力,有助于其在感染部位定植,并可形成细菌生物膜或侵袭进入细胞,造成耐药性更高、可逃避宿主免疫的更为顽固的细菌感染。一方面,鲍曼不动杆菌感染的发生率近年来一直居高不下,目前已成为最为常见的院内感染病原菌之一;另一方面,鲍曼不动杆菌感染一旦发生,其疗程长、结局差,且治疗的药物选择非常受限。鲍曼不动杆菌主要造成院内感染,最常累及呼吸道,多继发于免疫力受损的患者,此时患者往往已接受过抗菌药物治疗。目前,临床分离鲍曼不动杆菌对多数常见抗菌药物的耐药率均已超过50%,因此常规治疗药物在暴露于鲍曼不动杆菌时,多处于不能杀灭病原菌的亚抑菌浓度(Sub-minimum inhibitory concentration,sub-MIC)水平,而即便是敏感的药物,在达到治疗浓度前也存在不可避免的亚抑菌浓度阶段。但是,目前较少有关于亚抑菌浓度药物对临床分离鲍曼不动杆菌影响的研究。现已有大量研究提示,抗菌药物的本源是细菌释放的小分子活性物质,其能够在不杀灭细菌的浓度下,影响细菌的一系列生理病理行为,如增殖、粘附和细菌生物膜形成等,这种调控作用可显著影响到感染的发生和进程。但亚抑菌浓度药物会对鲍曼不动杆菌感染与治疗的进程产生怎样的影响,或利或弊?恰当的药物选择是否可为感染的有效预防或成功治疗赢得机会?目前尚缺乏足够的研究给予提示。结合国内外关于亚抑菌浓度药物影响细菌病原学行为的研究进展,本课题拟研究处于亚抑菌浓度下的药物对鲍曼不动杆菌的粘附定植、生物膜形成、侵袭等行为的影响及其机制。研究的结果可丰富sub-MIC影响细菌病原学行为的现象与理论,更有助于为ICU等鲍曼不动杆菌广泛播散的医疗机构内,如何合理地使用抗菌药物提供有价值的参考。研究目的研究抗菌药物在亚抑菌浓度下,对鲍曼不动杆菌生物膜形成、粘附侵袭等病原学行为的影响及其主要的机制。研究方法1.临床鲍曼不动杆菌耐药性与流行病学研究本课题累计共收集773株临床分离鲍曼不动杆菌,其中697株来源于河南省人民医院,另有75株临床分离菌来源于中国人民解放军陆军军医大学(原第三军医大学)附属新桥医院。临床分离菌株的最低抑菌浓度检测采用琼脂平板稀释法;受限于样本数量,流行病学的研究选取样本量满足需求、既往耐药性强的河南省人民医院分离菌为对象,研究方法包括主要耐药基因型的鉴定和多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MSLT)。基因型的鉴定采用细菌基因组的PCR扩增法,而MSLT分型通过7对管家基因的扩增、测序并序列比对,获得等位基因和菌株的序列型(sequence type,ST)。2.亚抑菌浓度抗菌药物对鲍曼不动杆菌形成细菌生物膜、粘附和侵入人呼吸道上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)的影响在耐药性研究基础上,选取耐药性较强、生物膜形成显著的10株具代表性的临床分离多重耐药(multidrug resistance,MDR)菌株。选取15种常用抗菌药物,研究其在亚抑菌浓度下对临床分离鲍曼不动杆菌生物膜形成的影响,获得具有显著抑制作用的药物,并研究药物对鲍曼不动杆菌ATCC 17978的作用。生物膜形成的研究方法采用微孔染色法(24 h),对代表菌株ATCC 17978和WB1549,则利用更加接近体内环境的生物膜研究的Flow-Chamber系统,对前期筛选中作用较显著的药物阿奇霉素(azithromycin,AZM),进行生物膜形成(72 h)影响的研究,确证药物对ATCC 17978和临床分离株WB1549的生物膜形成的作用。进一步通过体外培养HBE细胞,建立体外鲍曼不动杆菌的细胞感染模型,研究亚抑菌浓度药物对鲍曼不动杆菌ATCC 17978与WB1549在HBE细胞上粘附、侵入HBE细胞的情况。粘附菌量的测定和观察分别采用平板菌落计数法和激光共聚焦荧光染色观察法进行,侵入菌量的测定采用平板菌落计数法进行。3.亚抑菌浓度抗菌药物对鲍曼不动杆菌病原学行为影响的机制研究以ATCC 17978为研究对象,采用RNA-seq法进行全基因组表达谱分析,比较阿奇霉素作用前后细菌全基因转录谱的变化,对筛选出的9个关键基因以QPCR法分别在ATCC 17978和临床分离株WB1549中进行表达差异的研究;分别通过细菌泳动试验、扫描和透射电子显微镜观察,研究和验证阿奇霉素对生物膜形成、粘附和侵入宿主细胞等病原学行为的显著影响;继而采用ELISA法或western blot法研究宿主细胞HBE的IL-8、TNFα释放、Toll样受体2,4的表达情况,在此基础上进一步通过特异性抑制等方法,研究阿奇霉素作用前后对细菌侵入行为的变化,探讨其运动、粘附等病原学行为改变的主要机制。研究结果1.鲍曼不动杆菌的耐药性显著增强,耐药菌株播散加快,使鲍曼不动杆菌感染常规治疗时暴露于亚抑菌浓度药物的情况更为普遍(1)耐药性分析发现,近10年间除米诺环素等少数应用较少的抗菌药物外,河南省人民医院鲍曼不动杆菌对常见抗菌药物的耐药率增长显著,而新桥医院临床分离株对替加环素保有较高的敏感性;(2)在697株鲍曼不动杆菌中,发现了49个ST分型,其中既包括国内常见的分型,也包括较为罕见的分型,同时我们发现了7株携带NDM耐药基因的菌株在同一家医院集中出现的较为罕见的情况。2.阿奇霉素等部分亚抑菌浓度抗菌药物体外对MDR鲍曼不动杆菌临床分离株的生物膜形成具有较强的抑制作用,对粘附和侵入HBE细胞的影响的研究也得到较一致的结果(1)对鲍曼不动杆菌生物膜形成的作用,不同的亚-MIC抗菌药物均表现出一定的菌株特异性,但阿奇霉素和阿米卡星(Amikacin,AMK)等9种抗菌药物对多数菌株显示了对临床分离MDR鲍曼不动杆菌生物膜形成的抑制作用,其中以阿奇霉素作用相对最优。该作用在ATCC 17978中表现一致,并于Flow Chamber生物膜研究系统中得到验证(ATCC 17978和临床株WB1549);(2)通过体外培养HBE细胞建立体外鲍曼不动杆菌的细胞感染模型,采用平板计数法与激光共聚焦荧光染色观察法发现阿米卡星、阿奇霉素和头孢吡肟对ATCC17978和WB1549粘附于HBE细胞具显著抑制作用;(3)阿米卡星和阿奇霉素显示了对ATCC 17978和临床分离株WB1549侵入HBE细胞具显著的抑制作用,并以阿奇霉素的作用相对较强。3.阿奇霉素改变鲍曼不动杆菌的病原学行为的可能机制(1)全基因组表达谱分析显示,阿奇霉素(0.25μg/mL)作用后的鲍曼不动杆菌基因表达发生了较广泛的变化,其中显著上调基因264个,显著下调的基因422个(P<0.05),结合核糖体蛋白基因表达受普遍影响的情况,推测阿奇霉素作用的直接靶点仍然是核糖体蛋白。进一步的聚类分析结果显示,显著影响的基因主要以运动、粘附、生物膜形成、维持细胞结构等外膜蛋白及其合成、蛋白翻译、氧化应激等为主;(2)对文献已有报道的和本研究中已观察到的显著变化基因,包括运动、粘附、生物膜形成有关的外膜蛋白基因进行验证,发现ATCC 17978和临床分离株WB1549的菌毛合成、外膜蛋白(OmpA)、bmf等基因表达均在阿奇霉素作用后大幅度降低;(3)ATCC17978的泳动试验显示,阿奇霉素作用后其移动能力受到显著抑制,结合基因表达的研究结果,推测其与Ⅲ型菌毛合成抑制有关;(4)首先,ATCC17978的形态学观察提示,阿奇霉素作用后鲍曼不动杆菌粘附和侵入宿主细胞的模式发生改变,其中鲍曼不动杆菌侵入HBE的“拉链样”模式受到抑制。“拉链样”模式系由宿主细胞肌动蛋白介导的细菌内化,需细菌表面配体与细胞上受体直接结合,而进一步通过肌动蛋白抑制剂细胞松弛素(cytochalasin D)处理HBE细胞后,阿奇霉素对细菌侵入细胞的抑制作用消失,提示阿奇霉素作用后的鲍曼不动杆菌外膜中与HBE细胞表面受体结合的配体有所减少;(5)相较未处理的ATCC17978,阿奇霉素处理鲍曼不动杆菌诱导HBE细胞释放IL-8有显著减少,TNFα未见显著变化;阿奇霉素处理鲍曼不动杆菌感染HBE 6 h后Toll样受体2表达较阿奇霉素未处理组显著更低,提示细菌在阿奇霉素处理后,其表面可受Toll样受体识别的配体减少;由于实验未观察到脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)生物合成的基因表达有显著变化,加之宿主细胞免疫反应时间的滞后,我们推测阿奇霉素通过抑制Ⅲ型菌毛、外膜蛋白A(outer membrane proteinA,OmpA)、青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs)等与运动、粘附相关的外膜蛋白的生物合成,通过减少细菌-宿主细胞直接作用继而减少了Toll样受体的激动作用,从而抑制其侵入行为。结论鲍曼不动杆菌耐药性近年来显著增强、耐药菌株播散明显,其感染的治疗选择进一步受限且暴露于亚抑菌浓度水平药物的机会显著增加。我们发现体外阿奇霉素、阿米卡星等抗菌药物虽难以清除鲍曼不动杆菌,但可显著抑制其生物膜形成。本研究进一步通过抗菌药物-细菌-宿主间作用的研究发现阿奇霉素对鲍曼不动杆菌ATCC17978和临床分离株WB1549粘附和侵入HBE细胞等病原学行为具有显著的抑制作用,相关作用尚未见文献报道。机制研究的结果提示,阿奇霉素可广泛影响鲍曼不动杆菌的膜结构和相关的功能,包括对Ⅲ型菌毛、OmpA、PBPs、bmf等与运动、生物膜形成和宿主相互作用有关的外膜蛋白表达呈现了显著的抑制作用,使鲍曼不动杆菌移动能力降低,生物膜形成减弱和粘附侵入等与宿主的相互作用受到抑制,并通过减少对宿主细胞Toll样受体的激活,导致肌动蛋白介导的HBE细胞对细菌的内化作用减弱,从而显著抑制侵入宿主细胞等病原学行为。由于阿奇霉素为呼吸道感染经验治疗时最常选用的药物之一,其暴露于鲍曼不动杆菌时常处于亚抑菌浓度水平,必然也会对该细菌病原学行为产生影响,乃至影响感染治疗的进展与结局。本研究的结果可对亚抑菌浓度阿奇霉素进一步的研究奠定良好的基础,以期为临床更合理有效地使用抗菌药物提供有益的参考。