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目的:PCR技术是20世纪末分子生物学领域的重大成果,因特异性强、灵敏度高以及对样本纯度要求低等优点,PCR技术被广泛运用于遗传病研究、肿瘤发病机理探讨、生命科学研究等领域。21世纪初,在新发突发传染病检测和应对、灾后食物和饮用水的安全检测、生物反恐等领域,采用PCR对未知样本检测的技术更是在现场得到了广泛的应用。与PCR技术应用相辅相成的是核酸扩增系统的研究和发展,作为完成样本扩增的主要部分,核酸扩增系统工作参数直接影响着扩增速度、扩增效率以及扩增结果准确性。传统核酸扩增系统面向的往往是实验室生命科学研究,主要特点是稳定性好、反应通量大,但是在诸如食品饮用水安全检测、生物反恐等领域的现场应用中,传统的核酸扩增系统在系统便携化程度、扩增速度以及结果准确性方面存在不足。此外,现场应用中为了对未知样品进行快速检测,使用者往往需要对扩增程序进行筛选,传统核酸扩增系统根本没用相应的设计和功能。为了推动PCR技术在现场快速检测的应用,有必要对现有核酸扩增系统进行研究和改进,实现仪器的便携化、扩增的快速化和准确化并支持扩增程序筛选。方法和内容:针对传统核酸扩增系统在现场快速检测应用中所面临的问题,本文从核酸扩增系统工作原理入手,研究用于快速检测,支持扩增筛选的快速化、准确化和便携化核酸扩增系统。主要研究内容包括以下几个方面:1.以扩增系统升降温速度作为首要指标,对不同核酸扩增系统热源和换热方式进行热力学分析,依据换热过程传热系数和系统实际升降温参数选择合理换热方式和系统热源;2.以便携化为目标进行反应腔结构设计,设计过程中考虑结构的可集成化程度,保证其内部结构有利于热源热量的传递,换热过程有足够的换热强度;3.选择系统的热量传递模块,利用ANSYS软件对反应腔内部温度均一性进行仿真,并对实际的核酸扩增系统不同区域进行温度实验,记录各处的温度值,结合仿真结果和实验结果评价系统内部温度均一性、升降温速度、精确度是否满足设计要求;4.针对核酸扩增系统普遍存在的样本热源温度延迟问题,分析核酸扩增系统热源热量传递至样本的理论时间常数。以本文设计的核酸扩增系统为平台,计算其独立反应腔的样本与热源温度理论延迟,通过具体温度实验,测量并计算反应腔的实际温度延迟。根据理论延迟分析和实际延迟计算,选择合理的温控时间,从热源热量传递至样本过程的换热机理上对系统温度延迟进行优化,提高整体扩增速度;5.采用本文设计的面向现场检测核酸扩增系统进行扩增实验,扩增结果与标准PCR扩增结果通过电泳进行比对,依据比对结果评价本文核酸扩增系统扩增效果。结果:1.通过对比气浴式和变温金属块式核酸扩增系统热量传递模块的传热系数,得知气浴式核酸扩增系统的热量传递过程较变温金属块式更为简单,气浴式系统的传热系数大于变温金属块式。结合实际PCR仪工作参数,选择气浴式作为本文核酸扩增系统换热方式;2.在以气浴式为换热方式的基础上,计算以电热丝和红外线灯作为热源的系统内部热源与空气的换热强度,综合考虑不同热源下实际产品的升降温速度以及其体积参数,选择电热丝作为本文核酸扩增系统热源;3.提出利用多个独立微型反应腔进行独立扩增的设计方案以实现扩增程序筛选,在保证反应腔内部空气与反应管对流换热强度的基础上,对微型反应腔结构进行设计,最终选择高宽比为2:1的矩形截面通道作为反应腔,规格参数为80mm×40mm×20mm(长×高×宽);4.放弃了传统气浴式核酸扩增系统占用体积较大的搅拌风机设计,选用与矩形截面面积相同的90%孔隙率3mm厚的泡沫铜作为传热模块,均匀通道内部空气温度。经过CFD仿真和实验验证,得知通道内部空气均一性在±0.52℃,最大升温速度为10℃/s,最大降温速度为12℃/s,温度精确度为±0.55℃,满足设计需求;5.针对核酸扩增普遍存在的样本与热源温度延迟问题,对核酸扩增系统进行热力学分析,根据非稳态导热过程时间常数计算,计算热量从热源传递至样本各阶段的理论时间常数,依据分析和计算结果对样本与热源温度延迟进行优化。优化后的微型反应腔内部样本温度从变性降温至退火的时间约为19.4s,从退火升温至延伸阶段的时间约为8.1s,从延伸升温至变性阶段的时间约为6.4s,整个扩增过程较优化前的样本升降温速度有了明显改善;6.采用微型反应腔和标准PCR仪扩增枯草芽孢杆菌和单增李斯特菌,对比产物电泳图,可知微型反应腔扩增效果良好,满足设计需求;采用优化前后的微型反应腔对单增李斯特菌进行扩增,对比优化前后扩增产物的电泳图,可知经改变温差优化样本与空气温度延迟后,微型反应腔扩增效果有了一定提升。总结:文中设计了面向现场检测的核酸扩增系统,提出通过独立反应腔集成完成扩增程序筛选的方案。使用泡沫铜代替搅拌风机均匀温度提高换热效率解决了传统气浴式核酸扩增系统便携化、集成化程度低的问题。设计完成的系统内部单个微型反应腔体积为80mm×40mm×20mm(长×高×宽),最大升温速度为10℃/s,最大降温速度为12℃/s,温度精确度为±0.55℃,空气均一性在±0.52℃。通过样本扩增实验,可知扩增效果良好,满足设计需求。