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抗肿瘤免疫和抗感染免疫的关键点之一是诱导机体产生抗原特异性的Th1型免疫应答。利用免疫佐剂调节免疫反应使其向Th1型免疫应答偏向是一种可行的方式。传统佐剂以福氏佐剂为代表，主要诱导抗体产生，以Th2型免疫应答为主。随着免疫学研究的进展，一些新的具有佐剂作用的物质不断被发现，并逐步形成新一代的佐剂。新一代佐剂主要是一些免疫刺激物质和细胞因子，其中包括IFN-γ、IL-12、LPS、lipid A和CpG等。佐剂辅助抗原激发机体产生免疫反应，几乎都与抗原递呈细胞(Antigen-presenting cells,APC)尤其是树突状细胞(Dendritic cells,DC)的作用有关。近年来，大量研究发现热休克蛋白(Heat shockprotein,HSP)家族的许多成员具有佐剂效应，而且主要诱导机体产生抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL，以Th1型应答为主。HSP由于具有独特的佐剂效应而受到免疫学界的广泛关注。 HSP-DC(HSP derived from DC,HSP-DC)是我们从人外周血单核细胞来源的DC cDNA文库通过大规模随机测序发现的一种新分子(GenBank的登录号AF143723)，生物信息学分析表明该分子有典型HSP70家族的特征，和HSP70家族成员具有较高的同源性。本室前期的研究结果提示HSP-DC具有与HSP70类似的佐剂样效应。本课题的研究目的是在此基础上，进一步通过体内外试验，研究HSP-DC的佐剂效应机制及特点，同时研究HSP-DC与DC相互作用的效应，探讨二者相互作用的受体和信号转导机制，并期望通过研究发现该新分子的独特功能。研究分四个部分进行。 第一部分 重组HSP-DC蛋白的表达纯化和鉴定 从本室构建的含有HSP-DC cDNA的全部编码区序列的重组载体pGEX2T-HSP-DC用BamH Ⅰ和Sma Ⅰ酶切下HSP-DC cDNA的完整编码框，插入pQE30表达载体，表达N端带有6个组氨酸(His)尾的HSP-DC重组蛋白。筛选到经过酶切和测序确认的正确重组表达质粒后，转化大肠杆菌M15(pREP4)。转化子在2YT培养基中，用IPTG诱导表达，SDS-PAGE观察到约56kD的重组蛋白表达，主要出现在细菌包涵体中。为了得到没有LPS污染的HSP-DC蛋白，包涵体经过多次充分的洗涤，用鲎试剂检测为阴性后，再用8 M尿素溶解。变性蛋白通过His尾结合到Ni+螯合柱，洗去杂蛋白，柱上复性。复性洗脱的蛋白第二军医大学博士论文免疫学再用DEAE离子交换层析进一步纯化。纯化的重组HSP一DC蛋白通过SDS一PAGE电泳银染，证实纯度大于97%，用赏试剂检测LPS含量小于0.03p留，g蛋白。第二部分重组HSP一DC蛋白促进DC成熟和功能的研究 DC是体内功能最强的专职性抗原提呈细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节，己知的佐剂发挥佐剂效应，多与DC有关。因此，本课题对新分子HSP一DC的生物学功能的探究主要围绕DC进行。1.不同DC刺激因子对DC表达HSP一DC的影响:人外周血单核细胞来源的DC，按常规方法培养至第六天，分别给予40℃5分钟热处理，或用人IFN一Y、LPS、CpG、翎F一。、活化型抗CD40单克隆抗体及PMA按常规剂量刺激10小时，抽提细胞总RNA，通过以日一actin为内参照的RT一PCR，分析HSP一DC在mRNA水平的表达情况。结果发现，与未施加任何处理的DC相比，热休克、CpG、LPS处理最显著地上调了DC的HSP一DC mRNA水平，同时诩F一。、IFN-Y和活化型抗CD40单抗也能次显著地上调HSP一DC的mRNA水平。提示HSP一DC具有应激表达的特性，DC内HSP一DC的表达可能与DC的功能相关。2.HSP一DC诱导DC分泌趋化因子:培养至第七天的DC，分别与0.1、3、6.25、一2.5、25、50 09/ml的重组Hsp一DC蛋白共孵育72小时，收集细胞培养上清，用定量ELISA试剂盒检测上清中Ip一10、Mlp·la、Mlp一lp和RANTEs的含量，结果这几种趋化因子的产生水平与HSP一DC的作用呈明显的剂量依赖关系，并据此结果选择HSP一DC对DC作用剂量为10协g/ml:与前述条件相似，用1 0 p g/ml重组HSP一DC与DC分别作用0、4、24、72小时，发现HSP一DC刺激DC分泌IP一10、MIP一la、MIP一lp和RANTEs呈明显的时间依赖关系。同样条件下，同样浓度的HSP70不能刺激nC分泌xP一10，诱导产生MIP一la、MIP一lp和RANTES的水平也明显低于HSP一DC(P<0.05);对照蛋白His一CK(N端带有6His的重组线粒体肌酸激酶)、通过煮沸变性的HSP一DC都没有诱导DC产生上述趋化因子的能力，但LPS刺激的阳性对照组能检出较高浓度的上述趋化因子，表明该作用是HSP一DC的生物学功能，而不是其重组蛋白中可能会有的LPS污染或N端6HIS的作用。3.HSP一DC诱导oC分泌前炎性细胞因子:用10“g/m 1 HSP一oe、HsP7o、His一CK和1 pg/m 1 LPS分别刺激培养至第五天的DC，24小时后用定量ELISA第二军医大学博士论文免疫学方法测定上清中IL一12、IL一1卜、TNF一a的含量，为排除所用蛋白中含有LPS的可能，每一刺激因子又分成三种不同处理:天然蛋白形式，煮沸变性的形式，天然蛋白加50 pg/ml的PMB(LPS抑制剂)。结果发现，HSP一DC和HSP70都能诱导DC产生IL一12、IL一lp、TNF一a，但HSP一Dc诱导组产生的IL一12水平显著高于HSP70诱导组(尸<0.05)。PMB能显著抑制LPS诱导 ne产生I