【摘 要】
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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种接触性、急性烈性传染病。猪瘟对我国的养猪业造成巨大的经济损失,所以它已被我
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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种接触性、急性烈性传染病。猪瘟对我国的养猪业造成巨大的经济损失,所以它已被我国列为要消灭的重大动物疫病之一。国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)也将其列为优先防治的一类动物疫病。目前,对于猪瘟的预防和控制,主要依靠疫苗接种和捕杀。猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)是预防猪瘟的最有效的疫苗。该疫苗株引起家兔产生定型热反应,并且能在家兔的脾脏和淋巴结内复制。CSFV NS5A蛋白作为该病毒RNA复制酶复合物的成分之一,主要参与病毒基因组的复制。除此之外,NS5A蛋白还能够通过与宿主相互作用等方式,调节病毒基因组复制。本实验室在探究CSFV NS5A蛋白与宿主的翻译延伸因子1A(translation elongation factor 1A,eEF1A)相互作用的过程中,经Western blotting检测,我们发现猪瘟病毒强弱毒株分子量存在差异。由于众多研究表明,NS5A蛋白主要参与病毒基因组的复制。那么,强弱毒株中NS5A蛋白分子量的不同是否对CSFV的强弱毒株产生不同的复制效率呢?为此,我们对NS5A蛋白在CSFV强弱毒株中的复制作用展开了深入的研究。首先,我们构建了表达海肾荧光素酶基因的嵌合报告病毒(r SM-Rluc-HCLVNS5A)以便于我们可以快速、高通量的对病毒复制情况进行定量。通过对报告病毒表达的荧光素酶进行活性分析,我们确定了NS5A蛋白对猪瘟病毒复制水平产生的影响。随后,我们构建了强弱毒株NS5A蛋白互换的嵌合病毒,通过对病毒滴度的测定和荧光定量PCR比较NS5A在强弱毒株上引起复制水平的差异。我们发现,与原有的报告病毒(r SM-Rluc)相比,嵌合报告病毒的Rluc活性下降;以强毒株为骨架,将弱毒株NS5A替换到强毒株后,嵌合病毒(r SM-HCLVNS5A)的基因拷贝数下降,病毒滴度下降大约30倍;以弱毒株为骨架,将强毒株NS5A替换后,嵌合病毒(r HCLV-SMNS5A)基因拷贝数提高,病毒滴度上升约5倍。最后我们在家兔体内了评价了r SM-HCLVNS5A和r HCLV-SMNS5A的定型热反应、复制和免疫原性,发现r HCLV-SMNS5A保持了HCLV株适应家兔的特性,没有影响HCLV株在家兔体内的复制效率,而r SM-HCLVNS5A与石门株相同,并没有引起家兔产生定型热反应,也不在家兔脾脏内复制。总之,本研究首次发现猪瘟病毒强弱毒株的NS5A的蛋白分子量是不同的,并且进一步证实NS5A能够引起猪瘟病毒强弱毒株的复制差异;体内实验发现NS5A的替换并没有改变HCLV株适应家兔的特性,同时也没有影响HCLV株在家兔体内的复制水平。本研究为探究强弱毒株之间的复制效率差异提供思路。
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