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研究背景:随着我国社会人口老龄化的加剧,老年人的健康问题越来越受到关注。老年患者作为糖尿病的主体人群,糖尿病的心脑血管并发症的发生是临床上致死和致残的重要原因,而动脉粥样硬化是糖尿病最常见的心脑血管并发症。但其病因尚未完全阐明。内皮细胞的过度凋亡是内皮细胞功能障碍的重要表现形式,同时也是动脉粥样硬化形成的始动因素。有研究表明长期高糖刺激,血管内皮细胞的主要特征是在转录因子调节下,产生一系列相关因子,导致内皮细胞功能障碍,引起糖尿病血管并发症的发生和发展。高糖在内皮细胞凋亡中起着重要作用,高糖诱导氧化应激,通过一系列复杂信号通路直接或间接引起血管内皮细胞凋亡。高糖引起内皮凋亡的机制很多,如氧化应激、内质网应激、钙离子内流。其中Ca2+浓度升高是其重要机制。钙库依赖性钙通道(SOCC)在细胞凋亡增殖起着重要作用。但高糖对其具体调节机制尚需进一步研究。AMPK是由α、β、γ三个亚基组成的异源三聚体,α亚基行使催化功能、β和γ亚基行使调节功能。α亚基有α1和α2两个亚型,在内皮细胞中AMPKα1和α2均有表达,但以表达以α1亚单位为主。最近的证据表明AMPK在延缓动脉粥样硬化的形成和保护血管功能等过程中充当重要的角色,但其具体机制尚需进一步研究。研究目的:本研究以离体培养胰腺血管内皮细胞(MS1)和构建糖尿病动脉粥样硬化小鼠模型为研究对象,采用激光共聚焦检测钙内流、TUNEL检测内皮细胞凋亡等方法,力图证实:1)、AMPK抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡;2)、高糖诱导的内皮细胞凋亡与钙离子内流相关;3)、AMPK抑制高糖诱导的ROS生成;4)、AMPK抑制高糖介导的SOCC蛋白表达以及钙离子内流;5)、AMPK抑制动脉粥样斑块形成。研究方法:1、采用离体培养MS1内皮细胞株,应用TUNEL法检测内皮细胞凋亡。细胞分6组为:高糖组(30m M高糖刺激48h)、AMPK激动剂组(1m MAICAR预处理2h)、高糖+AICAR组(30m M高糖处理48h+1m MAICAR预处理2h)、SOC通道抑制剂组(100u M2-APB预处理2h)和高糖+SOC通道抑制剂组(30m M高糖处理48h+100u M 2-APB预处理2h),另外设立对照组(未用任何处理因素)。2、采用激光共聚焦检测钙离子内流情况,将共聚焦培养皿中培养的内皮细胞置于Hank液中,应用特异性的荧光染料Fluo-3AM检测内钙离子浓度。细胞分组为对照组、高糖组、AICAR组、高糖+AICAR组、SOC通道抑制剂(2-APB)和高糖+SOC通道抑制剂组。3、采用DHE探针观察细胞内ROS形成,将内皮细胞接种于六孔板中,细胞孵育DHE探针后于荧光显微镜下观察ROS生成。细胞分组为对照组、高糖组、AICAR组、高糖+AICAR组。4、采用Western Blotting技术检测SOCC蛋白。内皮细胞以105密度接种于六孔板中,每组三个副孔,细胞分组为对照组、高糖组、AICAR组、高糖+AICAR组,以1m M AICAR预处理2h,再给予高糖刺激48h。用PBS清洗细胞两次后,收集各组细胞,应用WB技术检测AMPK对SOC相关Stim1、Orai1蛋白表达的影响。5、采用油红O、HE染色观察主动脉斑块形成。实验分组为普通饲料组、高脂组、STZ组、STZ组+对照病毒组、STZ组+AMPKα1过表达组,取小鼠胸主动脉,纵向切开后,采用油红O染色观察主动脉血管内斑块形成,其余血管制成石蜡切片后,利用HE染色观察AMPK对动脉粥样硬化形成的影响。研究结果:1.高糖处理血管内皮细胞后凋亡明显增多(P<0.05),而与高糖刺激组相比,预处理AMPK激动剂能显著抑制高糖刺激的内皮细胞凋亡(P<0.05)2.高糖刺激内皮细胞后钙离子内流明显增加,而给予2-APB预处理后,高糖介导的内皮细胞凋亡和钙内流明显能被SOC通道抑制剂抑制(P<0.05)3.高糖刺激内皮细胞后,细胞内ROS生成增多,而给予AICAR预处理后,高糖诱导的ROS生成明显能被AMPK激动剂AICAR抑制(P<0.05)4.高糖刺激内皮细胞后,Stim1、Orai1蛋白表达增加,而与高糖组相比,高糖+AICAR组能够明显抑制Stim1、Orai1表达和钙内流(P<0.05)5.与高脂饲料组相比,小鼠给予STZ诱导糖尿病后,主动脉粥样斑块形成明显,而给予AMPKα1过表达慢病毒注射后,主动脉斑块形成明显减少(P<0.05)结论:1.高糖诱导内皮细胞凋亡,而AMPK能显著抑制高糖诱导的内皮凋亡。2.高糖诱导的内皮凋亡与钙内流相关,SOC通道介导高糖诱导的钙内流。3.高糖诱导ROS生成,而AMPK能显著抑制高糖诱导的ROS产生。4.AMPK能够显著抑制高糖诱导的Stim1、Orai1蛋白表达增加,并通过SOC蛋白抑制高糖介导的钙内流。5.AMPK抑制糖尿病致动脉粥样硬化斑块形成