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目的 探讨唾液乳杆菌JCM1231对茄病镰刀菌(Fusarium solani,F.solani)的抑制作用,并进一步探索其发酵上清(L.Salivarius culture filtrate,LSCF)对小鼠角膜基质细胞(murine keratocytes,MKs)茄病镰刀菌感染的抑制作用;方法 1、培养唾液乳杆菌JCM1231并绘制生长曲线、制备LSCF;同时培养F.solani,制备孢子悬液;2、采用双层平板法、牛津杯法琼脂扩散实验、孢子萌发抑制实验,探索唾液乳杆菌JCM1231对F.solani的抑制作用;3、初探LSCF中抗真菌物质的一般生物学活性:分别将LSCF的p H调整至2.0~9.0,经蛋白酶K及不同温度处理后,采用微量滴定法及孢子萌发抑制实验观察p H、温度及蛋白酶K对LSCF抗真菌活性的影响;4、培养MKs,建立F.solani感染模型;用MTT法测定LSCF对F.solani的有效抑菌浓度及LSCF对MKs的安全作用范围,进而确定LSCF的安全实验浓度;5、实验分4组进行:正常组(F.solani-/LSCF-)、感染组(F.solani+/LSCF-)、干预组(F.solani+/LSCF+)、对照组(F.solani-/LSCF+);用MTT法检测细胞活力、Annexin-V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡、RT-q PCR及ELISA方法检测致炎因子IL-6,TNF-α的表达情况。结果 1、肉眼观察发现:唾液乳杆菌JCM1231呈乳白色、边缘清晰、直径0.5~1mm大小菌落,液体培养基静止后可见白色沉淀;镜下观:革兰氏染色呈紫色,G+,短棒杆状,长短均一,初步鉴定为唾液乳杆菌;生长曲线近“S”形;2、双层平板法:唾液乳杆菌菌线周围抑菌圈面积(6.225±0.895cm2)占平皿面积的9.8%,抑菌作用呈强阳性(+++);牛津杯法琼脂扩散实验:LSCF组抑菌圈直径(22.475±0.767mm)较MRS组(3.855±0.035 mm)差别具有统计学意义(P<0.05);孢子萌发抑制实验:LSCF组孢子萌发抑制率(0.995±0.007)较MRS组(0.000±0.000)差别具有统计学意义(P<0.05);LSCF组平板菌落计数(活菌数:0.5±0.7)较MRS组(活菌数:96±0)差别具有统计学意义(P<0.05);3、经蛋白酶K处理的LSCF抑菌能力下降;且随着处理温度上升,抑菌效果轻度下降;p H在2.0~4.0范围内抑菌活性最强,p H大于5.0活性开始急剧下降,p H(29)6.0几乎丧失抑菌活性;4、MTT结果提示:共同孵育6小时,孢子与细胞浓度比8:1即可使细胞活力下降36%、LSCF最小有效抑菌浓度为5ug/ml、LSCF安全浓度范围是0~15ug/ml;确定15ug/ml作为LSCF的安全有效浓度,进行后续实验;5、统计学分析发现:F.solani+/LSCF+组与F.solani+/LSCF-组相比较,细胞活力提高、细胞凋亡率及IL-6、TNF-α表达水平下降,差别均具有统计学意义(P(27)0.05)。结论 1、LSCF能够显著抑制茄病镰刀菌孢子萌发及菌丝生长,其主要抗真菌物质可能是一种酸性p H依赖的、对蛋白酶K敏感的蛋白质多肽类物质,具有热不稳定性;2、LSCF通过增强细胞活力、抑制凋亡、下调致炎因子IL-6,TNF-α的表达,有效抑制小鼠角膜基质细胞茄病镰刀菌的感染。