论文部分内容阅读
1三氧化二砷通过抑制过氧化氢酶基因表达促进人成骨肉瘤MG63细胞的凋亡骨肉瘤主要好发于青少年，许多患者在术后联合化疗取得的效果并不理想。因此迫切需要新的治疗方案。考虑到骨肉瘤的主要患者群体为青少年，需要较长的生命预期，并考虑到长期化疗所产生的副作用。所以新的对机体长期累积的毒副作用小的治疗方案对于有效的化疗是至关重要的。三氧化二砷在治疗白血病等恶性瘤中取得了很大的进展。而三氧化二砷对p53突变的骨肉瘤效应的作用机制目前还尚未清晰。目的：为了检测三氧化二砷对人成骨肉瘤MG63细胞的效应，并研究其作用的分子机制。方法：通过Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡，活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧水平，过氧化氢酶活性试剂盒检测细胞内过氧化氢酶活性以及实时PCR检测细胞内过氧化氢酶的mRNA水平。结果：三氧化二砷从10μM浓度开始，处理组与对照组相比已有明显差异(P<0.05)，MG63细胞的凋亡率显著增高，呈剂量依赖的促凋亡作用，在10mM的NAC和CAT作用下，可以有效使细胞避免三氧化二砷的促凋亡作用；细胞内ROS水平从5μM三氧化二砷作用开始，与对照组相比已有明显差异(P<0.05)，呈剂量效应关系，更为重要的是，在10mM的NAC与CAT作用下，可以有效减少细胞内ROS水平，与上述凋亡结果相一致；在5μM及20μM浓度的三氧化二砷作用下，细胞内catalase活性被显著抑制(P<0.05)；在5μM及20μM浓度的三氧化二砷作用下，catalase的mRNA水平显著下调(P<0.01)。结论：诱导细胞凋亡是三氧化二砷对MG63细胞的重要效应。其作用机制是砷化物抑制该细胞的过氧化氢酶基因表达，减少了细胞过氧化氢酶分子数量，从而破坏了细胞对活性氧化物（ROS）的重要清除机制，致使细胞内ROS过量蓄积而引起细胞凋亡。2三氧化二砷抑制黑色素瘤B16细胞增殖并促进其凋亡由于环境污染的加剧，臭氧层不断遭到破坏，人类接触紫外线几率不断上升，黑色素瘤的发病危险显著增加，故黑色素瘤每年的发病率在急速上升，尤其好发于户外活动较多青年壮年人群。一旦进展至中晚期，黑色素瘤就会非常易于侵袭和转移，而目前尚无有效地解决方法，预后较差。因此需要长期有效毒副作用小的化疗方案。目的：为了检测三氧化二砷对黑色素瘤B16细胞有何效应，并研究其作用的分子机制。方法：通过CCK-8检测细胞增殖能力，细胞周期检测试剂盒检测细胞周期，Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。结果：三氧化二砷从5μM浓度开始，处理组与未处理的对照组相比，B16细胞的增殖率就开始明显下降（P＜0.05），随着剂量的增大，细胞增殖率的下降越来越明显，呈剂量效应关系，其IC50值为65.3±6.5μM；三氧化二砷在5μM浓度作用24h，与0h相比增殖率明显减低（P＜0.05），在作用48h时，细胞增殖抑制的效果更加显著（P＜0.01），48h以后结果差别与48h结果相近；砷作用组细胞与未处理组相比，处于S期的细胞数量减少， G0/G1期细胞数量增多，其SPF值、PI值明显低于对照组（P＜0.05）；三氧化二砷从5μM浓度开始，处理组与未处理组相比，细胞凋亡率明显增加（P＜0.05），且呈剂量效应关系，IC50值为70.4±3.6μM。结论：三氧化二砷对B16细胞的效应表现为抑制细胞增殖和促进细胞凋亡；抑制细胞增殖是通过阻断细胞周期中G1→S时相进程来实现的。3三氧化二砷对过表达Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的B16细胞增殖的抑制2006年，据takahashi和yamanak报道将四个转录因子Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc(OSKM)通过逆转录病毒转导到成熟分化的小鼠成纤维细胞中，使其重新编程至多能干细胞的过程，简单来说，就是将Oct4等四个转录因子转入成熟体细胞，形成类似胚胎干细胞样的多能干细胞。最近有人用肿瘤细胞系作为受体，将转录因子oct4转入肿瘤细胞中分离出肿瘤干细胞。肿瘤干细胞是肿瘤起始细胞，决定了肿瘤的发生，发展、转移和预后复发。因此本研究将四因子转入B16细胞中为了检测转染后细胞与肿瘤干细胞的关系。而将这些因子转入肿瘤细胞，需要一个合适的载体。3.1可调控载体介导的四因子在B16细胞中的表达目的：为检测四因子在肿瘤细胞中有何作用，能否将肿瘤细胞诱导为肿瘤干细胞，从而达到探寻恶性难治性肿瘤的发病机制，建立合理有效的治疗方案的目标。方法：运用质粒转染技术，将TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA两个质粒共同转染至B16细胞中，通过实时PCR，western blot、免疫细胞化学等方法鉴定转染后细胞在DOX调控下是否正常工作。结果：与母细胞相比15，16，20号克隆在DOX诱导24h后Oct4，Sox2，Klf4与c-Myc的表达量显著增高，而母细胞不受DOX调控，各基因表达都未有明显改变；DOX诱导组细胞内Oct4与c-Myc蛋白均有表达，而未诱导组几乎不表达；与对照组相比，DOX诱导组细胞浆与细胞核内表达均明显增强。结论：通过Tet-On驱动的四因子表达载体对B16细胞的转染，成功建立起可受DOX调控的稳定细胞株，为研究Oct4等四因子表达细胞的效应（调控前后互为对照）提供了理想的细胞模型。3.2四因子促进B16细胞增殖抑制其凋亡目的：为了研究表达四因子的细胞，与其母细胞是否存在差异，存在何种差异，这些差异能否成为探寻恶性难治性肿瘤的发病机制，建立合理有效的治疗方案的新途径。方法：通过CCK-8检测细胞增殖能力，细胞周期检测试剂盒检测细胞周期，AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡，实时PCR检测相关基因mRNA水平表达。结果：表达四因子组细胞与对照组细胞增殖速度明显不同，从24h开始，表达四因子细胞增殖的速度明显增快（P＜0.05）；表达四因子细胞与对照组相比，处于S期的细胞数增多，G0/G1期细胞数量减少，其SPF值、PI值明显大于对照组（P＜0.05）；表达四因子细胞的凋亡率明显低于对照组（P＜0.05）；与对照组相比，表达四因子细胞内有三个增殖相关基因的mRNA水平显著上调(P＜0.05)，分别为cyclinB1、JAK1和Stat3，抑制凋亡基因bcl2显著上调而促凋亡相关基因bax显著下调(P＜0.01)；正常培养条件下，表达四因子组与对照组细胞均呈短梭型，两组细胞形态上，无明显差异，在加入细胞因子条件下，5天开始，表达四因子细胞有细胞球形成，随着时间的增多两组细胞形成的细胞球数量开始有显著差异，培养两周左右，表达四因子组细胞形成细胞球数量明显增多（P＜0.05）。结论：Oct4等四因子在B16细胞的表达使细胞增殖能力增强﹑细胞凋亡受到抑制﹑肿瘤干细胞数量增加。促进细胞增殖是通过上调Cyclin B1、JAK1和Stat3的表达﹑加速细胞周期中G1→S时相进程来完成的。抑制细胞凋亡则是通过上调Bcl2及下调Bax基因表达机制实现的。肿瘤干细胞比例的增加表现为在干细胞培养条件下形成细胞球的数量增多。3.3四因子的表达增促移植瘤在小鼠体内的生长目的：为了进一步检测表达四因子的细胞在小鼠体内的情况。方法：运用表达四因子的细胞和对照组两组细胞分别皮下接种于C57小鼠，构建体内试验模型，用HE染色、实时PCR等方法检测两组细胞在体内增殖的情况，并对所得到的移植瘤细胞进行分析，探讨其作用的分子机制。结果：接种表达四因子的细胞及对照组细胞于C57小鼠皮下，接种对照组细胞的小鼠7d左右可于皮下摸到肿瘤，而接种表达四因子细胞的小鼠在5天左右即可以观察到肿瘤生成，肿瘤生长速度明显快于对照组，形成移植瘤体积及肿瘤重量具有显著差异(P＜0.01)；与对照组相比，表达四因子细胞形成的肿瘤组织在镜下显示：可见较多的细胞核分裂像（P＜0.05）；表达四因子细胞在小鼠体内形成的移植瘤细胞内，Oct4等四个基因的mRNA水平也显著上调（P＜0.05）；表达四因子细胞形成的移植瘤细胞内，与增殖相关基因cyclinB1和JAK1的mRNA水平也显著上调（P＜0.05）。结论：表达Oct4等四因子细胞在小鼠体内形成移植瘤的生长速度加快﹑显微镜下细胞核分裂像增多﹑Cyclin B1及JAK1基因表达水平上调，这一结果与体外细胞培养研究中发现的细胞增殖能力增强相一致。3.4三氧化二砷抑制表达四因子的B16细胞增殖并促进其凋亡目的：为了探讨三氧化二砷对表达四因子细胞的效应及其作用的分子机制。方法：通过CCK-8检测细胞增殖能力，细胞周期检测试剂盒检测细胞周期，Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。结果：三氧化二砷从5μM浓度开始，处理组与未处理的对照组相比，表达四因子细胞的增殖率就开始明显下降（P＜0.05），随着剂量的增大，细胞增殖率的下降越来越明显，呈剂量效应关系，其IC50值为23.1±6.3μM；三氧化二砷在5μM浓度作用24h，与0h相比增殖率明显减低（P＜0.05），在作用48h时，细胞增殖抑制的效果更加显著（P＜0.01），48h以后结果差别与48h结果相近；砷作用组细胞与未处理组相比，处于S期的细胞数量减少， G0/G1期细胞数量增多，其SPF值、PI值明显低于对照组（P＜0.05）；三氧化二砷从5μM浓度开始，处理组与未处理组相比，细胞凋亡率明显增加（P＜0.05），且呈剂量效应关系，IC50值为69.2±3.9μM。结论：三氧化二砷对表达Oct4等四因子细胞效应仍表现为通过阻断G1→S时相进程来抑制细胞增殖及促进细胞凋亡。4四因子促进三氧化二砷对细胞增殖的抑制目的：为了研究四因子对三氧化二砷作用于细胞的效应有何影响及其作用的分子机制。方法：通过CCK-8检测细胞增殖能力，细胞周期检测试剂盒检测细胞周期，Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。结果：表达四因子细胞与对照组的细胞生长均被不同程度的抑制，但表达四因子细胞的IC50值为23.1±6.3μM，明显低于对照组的IC50值65.3±6.5μM (P＜0.01)；在5μM三氧化二砷作用下，从24h起表达四因子细胞的增殖能力要显著低于对照组(P＜0.01），24h以后的结果差别与24h结果相近；5μM三氧化二砷处理的表达四因子的细胞，处于S期的细胞数量减少，G0/G1期细胞数量增多，其SPF值、PI值明显低于对照组（P＜0.05）；与对照组相比，表达四因子细胞的细胞凋亡率未有显著改变，IC50值也无明显差异。结论：Oct4等四因子的表达增加了B16细胞对三氧化二砷的敏感性：增加的敏感性表现为对细胞增殖的抑制、而非对细胞凋亡的促进作用。