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疟疾是一种严重危害人类健康的重要传染病,据世界卫生组织(WHO)报告,2015年全球约有2亿多疟疾病例,其中约43.8万人死于疟疾感染。卵形疟原虫(Plasmodium ovale)是4种主要人体疟原虫之一,主要分布于非洲和东南亚地区。卵形疟在非洲地区的流行率为3%~10.5%,在东南亚地区的流行率为1.6%~6.1%。大部分卵形疟患者症状较轻,易于治疗,但也不乏重症卵形疟病例的报道。以往卵形疟在我国较为罕见,而近年来我国输入性卵形疟病例明显上升。目前卵形疟原虫检测方面还存在诸多问题。外周血涂片显微镜检查卵形疟原虫不仅费时费力,而且与间日疟形态学鉴别非常困难。而核酸检测对实验仪器和操作水平要求较高,难以在基层普及。疟疾快速诊断试剂盒(RDTs)操作简便、耗时短、检测结果直观易判读,人员只需简单培训即可熟练操作,但是目前还没有专门针对卵形疟原虫的RDTs产品,部分报道提及RDTs对卵形疟的检测效果较差,但尚未见较为系统的RDTs检测卵形疟的效果评价及影响因素的分析。因此,本研究通过比较4种较为常见RDTs对卵形疟原虫的检测效果,分析原虫密度、靶标浓度、卵形疟原虫亚型和靶标多态性对检测结果的影响,为选择合适的RDTs产品检测卵形疟和进一步的产品研发提供科学依据。本研究主要包括以下三部分:第一部分 RDTs对卵形疟原虫的检测效果目的对常用的疟疾快速诊断试剂盒检测卵形疟原虫的效果进行评估。方法按照各试剂盒的说明书操作,分别采用Wondfo、CareStart、SD及Binax NOW四种rdts对经pcr确认的100份卵形疟患者血样进行检测,比较四种rdts对卵形疟原虫的检出率及不同rdts联合使用的检测效果。结果1.wondfo、carestart、sd及binaxnow对100份卵形疟血样的检出率分别为70%、55%、18%、37%,检出率比较差异有统计学意义(p<0.05),以校正αˊ=0.008,进行两两比较,结果表明sd的检出率低于其他3组,差异有统计学意义(p均<0.008)。以pan-adolase为靶标的binaxnow可以检出7例其它3种以pan-pldh为靶标的rdts均漏诊的样本。2.将四种rdts的检测结果进行两两组合,(wondfo+binaxnow)组合的检出率最高(78%),(sd+binaxnow)组合的检出率最低(40%)。(wondfo+carestart)、(wondfo+sd)和(wondfo+binaxnow)组合的检出率与wondfo比较差异均无统计学意义(p>0.05);(carestart+sd)和(carestart+binaxnow)组合的检出率与carestart比较差异也无统计学意义(p>0.05);(sd+binaxnow)组合的检出率与binaxnow比较差异也无统计学意义(p>0.05)。结论1.四种rdts对卵形疟原虫的检测效果均不理想,其中wondfo的检测效果相对较好,sd的检测效果最差。2.两种rdts联合使用时,(wondfo+binaxnow)组合的检测效果最好,(sd+binaxnow)组合的检测效果最差。rdts联合使用的检测效果与单独使用相比无显著性提高,但是基于pan-pldh和基于pan-aldolase的rdts联合使用可使卵形疟的检出率略有提高。第二部分 原虫密度与靶标浓度对rdts检测效果的影响目的分析原虫密度和靶标浓度对rdts检测卵形疟原虫效果的影响。方法1.由2名具有疟疾镜检能力合格证书的镜检员分别对100份卵形疟样本对应的血涂片进行显微镜检查,采用厚血膜计数法计算原虫密度。按原虫密度高低将所有样本分为3组:低原虫密度组≤500个/μl,中等原虫密度组为501个/μl~5000个/μl,高原虫密度组≥5001个/μl。比较4种rdts对不同原虫密度血样的检出率。2.采用quantimaltmpldhmalariacelisa试剂盒检测100份卵形疟血样中的疟原虫乳酸脱氢酶(pldh)浓度。按pldh检测的a值高低将所有样本分为3组:低浓度组a值≤0.100,中等浓度组a值为0.101~0.500,高浓度组a值≥0.501。比较以pan-pldh为靶标的3种rdts对不同pldh浓度血样的检出率。结果1.原虫密度≤500个/μl时,wondfo、carestart、sd及binaxnow的检出率分别为27.3%、36.4%、0%、9.1%;原虫密度为501个/μl~5000个/μl时,wondfo、carestart、sd及binaxnow的检出率分别为75.4%、45.6%、5.3%、17.5%;原虫密度≥5001个/μl时,wondfo、carestart、sd及binaxnow的检出率分别为75.0%、78.1%、46.9%、81.3%。wondfo对低原虫密度组的检出率低于中、高原虫密度组(p<0.017),carestart、sd和binaxnow对低、中原虫密度组的检出率低于高原虫密度组(p<0.017),sd对不同密度组的检出率均低于50%。2.当pldh浓度较低时(a值≤0.100),wondfo、carestart、sd的检出率分别为6.7%、16.7%、0%;当pldh处于中等浓度时(a值为0.101~0.500),wondfo、carestart、sd的检出率分别为95.1%、58.5%、4.9%;当pldh浓度较高时(a值≥0.501),wondfo、carestart、sd的检出率分别为100%、89.7%、55.2%。wondfo和carestart对低浓度组的检出率低于中、高浓度组(p<0.017),sd对低、中浓度组的检出率低于高浓度组(p<0.017)。结论1.rdts对卵形疟的检测效果与原虫密度有关,四种rdts对低原虫密度卵形疟样本(原虫密度≤500个/μl)的检测效果均较差,当原虫密度>5000个/μl时wondfo、carestart和binaxnow的检测效果均明显提高,但仍有一定数量的样本漏检。2.rdts对卵形疟的检测效果与靶标的浓度密切相关,三种以pldh为靶标的rdts在pldh浓度较低时的检测效果均较差,检出率随着pldh浓度的提高明显提高,但sd对pldh浓度较高的样本检出率仍不理想。第三部分 卵形疟原虫亚型与靶标多态性对rdts检测效果的影响目的分析卵形疟原虫亚型与靶标多态性对rdts检测卵形疟效果的影响。方法1.采用taqman探针实时荧光pcr法对100份卵形疟样本进行亚型的分型检测,并比较四种rdts对2种亚型的检出率。2.分别设计合成用于扩增卵形疟原虫ldh基因和aldolase基因的引物,对ldh基因和aldolase基因进行pcr扩增,产物直接测序或ta克隆后再测序,分析这2个基因的多态性对四种rdts检测卵形疟原虫效果的影响。结果1.taqman探针实时荧光pcr法检测100例卵形疟样本,52例为p.o.curtisi,48例为p.o.wallikeri。wondfo、carestart、sd及binaxnow对p.o.curtisi的检出率分别为73.1%、36.5%、0%、32.7%,对p.o.wallikeri的检出率分为66.7%、75%、37%、41.7%。wondfo和binaxnow对2种亚型的检出率的差异均无统计学意义(p>0.05);carestart和sd对p.o.wallikeri的检测效果优于p.o.curtisi(p<0.05)。2.100例卵形疟样本的ldh基因序列分析显示,2种亚型卵形疟原虫各自的ldh基因高度保守,同一亚型的ldh基因序列完全一致。2种亚型之间的ldh核酸序列同源性为97%,共有24个单核苷酸多态性(snp);编码氨基酸序列同源性为99.0%,共3个氨基酸残基的差异。3.本次试验共获得了100例卵形疟样本中77例样本的aldolase基因序列,其中34例为p.o.curtisi,33例为p.o.wallikeri。2种亚型卵形疟原虫各自的aldolase基因也较为保守,p.o.curtisi样本的aldolase基因序列同源性为100%,p.o.wallikeri样本中仅有1例样本存在1个同义突变。2种亚型之间的aldolase核酸序列同源性为97%,共有17个单核苷酸多态性(snp);编码氨基酸序列同源性为99.6%,仅1个氨基酸的差异。结论1.wondfo和binaxnow对2种亚型的检测效果均无差别;carestart对p.o.wallikeri的检测效果更好,对p.o.curtisi的检测效果较差;sd漏检了所有的P.o.curtisi样本,且对P.o.wallikeri的检测效果也不太理想。2.两种亚型之间的LDH有3个位点的非同义突变,这可能是造成SD漏检P.o.curtisi样本的原因;但2种亚型卵形疟原虫的LDH和Aldolase同源性均很高,同一亚型的序列高度保守,靶标多态性不是造成其它RDTs检测卵形疟原虫效果较差的主要原因。