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第一部分神经源性肺水肿家兔模型的制备背景神经源性肺水肿(Neurogenic pulmonary edema, NPE)是中枢神经系统(Central nervous system, CNS)损伤后急性的威胁生命的并发症,通常在严重CNS损伤后数分钟至数小时内发生。NPE缺乏流行病学数据资料,小儿患者NPE少见,但临床上容易漏诊。近年来,肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)感染所致手足口病成为重要的公众健康问题,重症感染患儿常合并中枢神经系统受累,并发NPE和心肺衰竭者预后不良,病死率、致残率高。NPE确切的发病机制至今仍未十分明确,主要有冲击伤理论-血流动力性学说和渗透缺陷理论-肺毛细血管通透性学说,目前普遍认为是这两种机制共同作用的结果,交感神经过度兴奋在NPE发生中起重要作用。多年来,国内外研究学者在深入研究其发病机制及治疗的过程中,建立了多种动物模型制备方法。目前,通过EV71感染的方式,可成功复制出中枢神经系统受累模型,但未复制出NPE。因此,本部分研究的目的是选择除EV71感染以外的其他方法,制备神经源性肺水肿模型,同时观察NPE发生过程中交感神经兴奋和血流动力学变化,为后续进行神经源性肺水肿的研究打下基础。目的1.复制神经源性肺水肿家兔模型。2.观察神经源性肺水肿发生过程中交感神经兴奋和血流动力学变化。方法1.18只健康成年新西兰兔随机分为3组：正常组6只,NPE组6只,生理盐水组(NS组)6只。2.NPE模型通过小脑延髓池注射纤维蛋白原和凝血酶诱发形成。3.家兔麻醉后按分组给予不同处理：①正常组：麻醉后不予其他处理,作为空白对照；②NPE组：麻醉后,进行手术操作(气管插管、PiCCO动静脉导管置管),小脑延髓池穿刺并注射纤维蛋白原和凝血酶；③NS组：麻醉后,进行手术操作(气管插管、PiCCO动静脉导管置管),小脑延髓池穿刺并注射等量生理盐水。4.实验过程中,正常组观察麻醉后0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h呼吸、心率变化；NPE组、NS组,1)观察小脑延髓池穿刺注射药物前后,呼吸(RR)、心率(HR)、平均动脉血压(MABP)的变化及其幅度变化；2)观察不同时点(基础状态B0,小脑延髓池穿刺注射后1min、5min、10min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h) MABP动态变化；3)分别于基础水平(B0)、注射后15min (P15min)、实验结束时(或P6h)留取血标本,检测血浆肾上腺素(EPI)、去甲肾上腺素(NE)浓度。5.实验结束后处死动物,立即开胸,观察气管导管有无水肿液自行溢出及肺胸膜下出血程度,评估肺水肿程度,并行组织病理形态学检查。结果小脑延髓池注射纤维蛋白原和凝血酶诱导了家兔神经源性肺水肿。各项观察指标变化如下：1)呼吸指标：各组的基础RR无统计学差异(P>0.05)。正常组在观察时间点内,呼吸无明显变化(P>0.05)。NPE组、NS组小脑延髓池穿刺注射后即刻(P1min),与基础水平(B0)相比,RR明显增快(P<0.01)；两组间RR增快的幅度(△RR)差异无统计学意义。2)平均动脉血压、心率变化：各组的基础HR无统计学差异(P>0.05)。正常组在观察时间点内,心率无明显变化(P>0.05)。NPE组、NS组小脑延髓池穿刺注射后即刻(P1min),与B0时比较,MABP升高(P<0.01),HR增快(P<0.05)；两组间MABP升高的幅度(ΔMABP)差异有统计学意义(P<0.01),HR增快的幅度(△HR)差异无统计学意义(P>0.05)。NPE组,MABP随时间有下降趋势,短时间内降至基础水平,甚至较低值；NS组,MABP随时间逐渐降至并维持于基础水平。3)血浆肾上腺素(EPI)、去甲肾上腺素(NE)水平：NPE组和NS组的EPI、 NE基础水平(B0)均无差异(P>0.05)。与B0相比,NS组EPI、NE水平在P15min、P6h均无明显变化(P>0.05)。与B0相比,NPE组EPI水平在P15min、 P6h均明显升高(P<0.01)；NE水平在P15min (P<0.01)、P6h升高(P<0.05)。NPE组与NS组相比,EPI水平在P15min、P6h均明显升高(P<0.01)；NE水平在P15min (P<0.01)、P6h升高(P<0.05)。4)气管导管水肿液：实验结束,开胸后不挤压肺,NPE组可见粉红色泡沫状液体自行从气管导管溢出；NS组、正常组均未见气管导管水肿液。5)肺组织肉眼观：NPE组肺组织明显肿胀,体积增大,边缘变钝,外观暗红,大片淤血,肺切面可见粉红色泡沫状液体。NS组、正常组肺组织无明显肿胀,边缘锐利,外观呈粉红色,无淤血,肺切面未见泡沫状液体。6)肺胸膜下出血程度：NPE组均有严重的肺水肿,各肺可见Ⅱ-Ⅲ级肺胸膜下出血,其中2/12为Ⅱ级,10/12为Ⅲ级；NS组和正常组均未见肺胸膜下出血,即肺胸膜下出血程度均为0级。7)肺组织病理形态学：NPE组家兔肺组织肺泡隔明显变宽,部分肺泡可见肺泡隔断裂,肺泡腔融合,红细胞浸润至肺间质或肺泡腔,有的肺泡腔内可见均质淡染的粉红色渗出物。NS组和正常组家兔肺组织肺泡隔正常,肺泡腔完整,未见红细胞浸润,肺泡腔干燥无渗出。结论1.小脑延髓池注射纤维蛋白原和凝血酶后,家兔发生交感神经兴奋改变。2.小脑延髓池注射纤维蛋白原和凝血酶后,家兔出现气管导管水肿液和肺组织病理学肺水肿改变。3.小脑延髓池注射纤维蛋白原和凝血酶的方法,可用于制备家兔神经源性肺水肿模型。第二部分AngⅡ系统在家兔神经源性肺水肿中作用的实验研究背景近年来研究发现,除了存在一个全身的肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS),机体多个器官和组织也存在独立的局部RAS。研究发现,急性肺损伤时,肺组织局部RAS激活,如急性呼吸窘迫综合征、胎粪吸入综合征、哮喘、严重急性呼吸综合征。因而我们探讨神经源性肺水肿(Neurogenic pulmonary edema, NPE)发生的肺损伤中,局部RAS是否激活,并观察血管紧张素转换酶抑制剂对于NPE的影响,从而为临床防治NPE提供新的突破口。目的1.在纤维蛋白诱导的NPE家兔模型中,探讨NPE发生时局部RAS是否激活。2.给予血管紧张素转换酶抑制剂干预NPE,观察其对NPE的影响。方法1.在NPE模型确认的基础上,添加NPE干预组,即依那普利拉组(Ena组),6只健康成年新西兰兔,造模15min后,静脉注射依那普利拉(0.5mg/kg)。实验中纳入的组别为正常组、NPE组、Ena组。2.实验过程中,观察Ena组不同时点(基础状态B0,小脑延髓池穿刺注射后1min、5min、10min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h)的呼吸(RR)、平均动脉压(MABP)、心率(HR)的动态变化。3.实验结束后处死动物,1)立即打开胸腔,观察气管导管有无水肿液自行溢出及肺胸膜下出血情况,评估肺水肿程度；2)留取左肺下叶,常规HE染色行病理组织形态学检查；3)留取右肺组织,测定肺组织Ang Ⅱ浓度及肺组织ACE、ACE2、AT1R mRNA表达水平。结果1.肺组织Ang Ⅱ水平NPE组较正常组(539.7±146.6vs253.4±37.2pg/ml)和Ena组(539.7±146.6vs308.7±35.4pg/ml)均增高(P<0.05); Ena组与正常组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。2.肺组织ACE、ACE2、AT1R mRNA表达水平RT-PCR结果显示：①ACE mRNA表达水平三组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),表达水平趋势为NPE组>正常组>Ena组。②ACE2mRNA表达水平与正常组相比,NPE组与Ena组ACE2mRNA表达水平均有下调(P<0.05); NPE组与Ena组比较,ACE2mRNA表达水平无差异(P>0.05)。③AT1R mRNA表达水平三组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。④ACE/ACE2mRNA表达水平三组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),趋势为NPE组>Ena组>正常组。3.肺水肿评估1)气管导管水肿液：正常组、Ena组气管导管内均未见粉红色泡沫水肿液自行溢出,NPE组气管导管内可见水肿液。2)肺胸膜下出血程度：正常组12/12为0级；NPE组2/12为Ⅱ级,10/12为Ⅲ级；Ena组2/12为Ⅰ级,8/12为Ⅱ级,2/12为Ⅲ级。4.组织病理学肺损伤评分肺泡过度扩张,Ena组vs NPE组,1.2±0.1vs2.8±0.4分,差异有统计学意义(P<0.01)；肺间质水肿,Ena组vs NPE组,1.3±0.2vs2.3±0.5分,差异有统计学意义(P<0.01)；肺泡渗出,Ena组vs NPE组,1.5±0.2vs1.8±0.3分,差异无统计学意义(P>0.05)。肺损伤总计得分,Ena组vs NPE组,1.3±0.1vs2.3±0.4分,差异有统计学意义(P<0.01)。正常组未见肺泡过度扩张、肺间质水肿、肺泡渗出,肺损伤评分为0。结论1.NPE发生时,家兔肺组织Ang Ⅱ浓度升高,ACE2mRNA表达下调,肺组织局部RAS激活。2.依那普利拉干预NPE,家兔肺组织Ang Ⅱ浓度、病理学肺损伤评分降低,提示血管紧张素转换酶抑制剂可能有减轻家兔NPE时肺损伤的作用。