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腹膜透析（Peritoneal dialysis,PD）是慢性肾功能不全终末期（End stage renal disease,ESRD）患者常用的肾脏替代治疗方法之一。而蛋白质营养不良是腹膜透析的一个非常常见的并发症,发生率高达60%,它是增加患者死亡率以及感染率的一个强烈危险因素。蛋白质经腹膜清除是导致蛋白质营养不良的一个重要原因。我们前期研究结果发现每日经腹膜透析丢失的蛋白质量约为4.04±1.97g/24h,足以造成低蛋白血症。但蛋白质经腹膜透析丢失的机制目前尚未阐明,一般认为与腹膜通透性增加有关,而调节通透性的途径有经细胞途径和细胞间途径两种。经细胞途径通过细胞膜上微囊（caveolae）或网格蛋白的特异囊泡介导的胞吞,大分子物质如白蛋白可借此通过单个内皮细胞。微囊蛋白-1（caveolin-1）是微囊的主要标记物,与微囊的表达及功能作用有关。但对于腹膜血管内皮细胞（HUM-CELL-0116）,白蛋白的转运是否依赖微囊/caveolin-1介导的大分子物质内吞尚未明确。本课题模拟腹膜透析的条件下,研究HUM-CELL-0116细胞是否表达微囊/caveolin-1以及微囊/caveolin-1是否参与转运异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）,旨在明确蛋白质经腹膜透析丢失的具体机制,为腹膜透析低蛋白血症的防治提供理论依据。[目的]1.明确腹膜血管内皮细胞是否有caveolin-1表达,进而评估是否存在微囊介导的大分子跨细胞转运途径。2.明确腹膜透析液能否促进白蛋白的跨内皮细胞转运。3.研究微囊/caveolin-1依赖的内吞作用是否参与了腹膜内皮细胞对白蛋白的转运。[方法]1.体外培养HUM-CELL-0116细胞,进行传代后分为5组:（1）对照组（DM）:只用培养液处理细胞;（2）PDS组（Peritoneal Dialysis Solution,腹膜透析液）:加1.5%腹膜透析液处理细胞;（3）PDS+Filipin组:用含2.5μg/ml或5μg/ml的Filipin+1.5%腹膜透析液共同处理细胞;（4）PDS+DMSO组:1‰的DMSO+1.5%腹膜透析液共同处理细胞;（5）PDS+caveolin-1抗体组:1‰的caveolin-1抗体+1.5%腹膜透析液共同处理细胞。2.以1.5%PDS为阳性对照组,通过细胞计数板测定细胞存活率,探寻干预0h、4h、12h、24h、48h后,80%以上细胞存活状态下PDS浓度,确保后续进行药物干预时具有实验意义。3.使用10%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）完全培养液处理细胞,除了对照组,其余各组均加入1.5%腹膜透析液,分别于处理0h、4h、12h、24h、48h后,采用Western blot方法检测caveolin-1的表达。4.应用Transwell小室搭建内皮细胞单层模型,使用FITC-BSA作为示踪剂,测定细胞在Transwell小室中的生长融合时间;待细胞生长融合后进行单层细胞通透性实验,分别于处理0h、4h、12h、24h、48h后,以FITC-BSA为示踪剂,检测各组单层细胞通透性。5.以FITC-BSA为示踪剂,置于荧光显微镜下观察细胞对FITC-BSA的内吞情况,进一步验证微囊/caveolin-1在HUM-CELL-0116细胞对白蛋白转运中的作用。6.将培养液的10%胎牛血清换为10%ESRD患者血清,重复步骤4。[结果]1.使用不同浓度梯度PDS的培养液处理细胞,浓度设置情况如下:以10%为浓度梯度,从0%至100%设置10组不同浓度PDS,并加入含10%FBS的完全培养液处理细胞,0h、4h、12h、24h、48h后,结果显示在50%PDS浓度时,各组细胞存活率仍可保持80%以上,整体差异显著,有统计学意义（P<0.05）,此浓度作为下一步实验浓度。2.腹膜内皮细胞caveolin-1表达情况:与对照组相比,PDS组caveolin-1表达在干预12h后开始下降;PDS+Filipin（2.5μg/ml）组、PDS+Filipin（5μg/ml）组、PDS+caveolin-1抗体组caveolin-1表达在干预4h后开始下降,PDS+Filipin（2.5μg/ml）组caveolin-1表达下降水平小于PDS+caveolin-1抗体组,而PDS+Filipin（5μg/ml）组caveolin-1表达下降水平大于PDS+caveolin-1抗体组;差异显著,有统计学意义（P<0.05）。但PDS+DMSO组与PDS组相比无显著差别。3.单层细胞通透性情况:（1）10%FBS完全培养基组:在0h组中,单层细胞通透性未见明显变化;在4h组中,与对照组相比,PDS组、PDS+DMSO组单层细胞通透性未见明显变化,PDS+Filipin（5μg/ml）组、PDS+caveolin-1抗体组单层细胞通透性有所升高,差别显著,有统计学意义（P<0.05）。在12h、24h、48h组中,与对照组相比,PDS组、PDS+Filipin（5μg/ml）组、PDS+caveolin-1抗体组单层细胞通透性明显升高,且PDS+Filipin（5μg/ml）组、PDS+caveolin-1抗体组较PDS组单层细胞通透性升高更为显著;PDS+DMSO组单层细胞通透性大于对照组,但较PDS组有所降低。（2）10%ESRD血清培养基组:各组总体趋势与10%FBS完全培养基组基本一致,但从12h开始,10%ESRD血清培养基组单层细胞通透性整体大于10%FBS完全培养基组;整体差异显著,有统计学意义（P<0.05）。4.FITC-BSA内吞情况:在荧光显微镜下,各组均未见HUM-CELL-0116细胞对白蛋白的显著内吞作用,提示在增大腹膜内皮细胞对白蛋白通透性的机制中,内吞可能不参与腹膜内皮细胞对白蛋白的跨细胞转运。[结论]1.腹膜血管内皮细胞有表达caveolin-1,提示存在微囊介导的大分子内吞作用。2.腹膜透析液使腹膜血管内皮细胞对白蛋白的通透性增加,提示腹膜透析液可增加腹膜内皮通透性,增加蛋白质丢失。3.荧光显微镜下未见到白蛋白内吞增加,同时非律平（Filipin）抑制微囊/caveolin-1依赖的物质内吞,但腹膜内皮细胞对白蛋白的通透性反而增加,提示微囊/caveolin-1依赖的内吞在腹膜内皮细胞白蛋白转运不起主要作用,腹膜内皮细胞白蛋白跨内皮细胞转运可能是依赖经细胞间途径导致的通透性增加,造成蛋白质经腹膜内皮细胞丢失。