论文部分内容阅读
利用比较基因组学等技术，本文成功地鉴定和克隆了2个鱼类免疫相关基因——黑青斑河豚ILF2基因(TnILF2)和IL-21基因(TnIL-21)。TnILF2cDNA序列长1380bp，其中5UTR长57bp，3UTR长159bp，ORF长1164bp。根据TnILF2的ORF推导出的多肽长387个氨基酸，分子量为42.9kD。在TnILF2多肽序列上存在多个修饰位点和功能位点，包括2个N-糖基化位点、多个磷酸化位点、1个富含RGG的单链RNA结合基序以及1个DZF锌指结构。氨基酸序列比较显示，TnILF2与其它物种ILF2蛋白的相似性为58％～93％。组织表达分析表明，在被检测的7个正常组织中，TnILF2基因为组成性表达；LPS诱导并不能显著改变TnILF2在这些组织中的表达量。将TnILF2CDS序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1+中，得到重组载体TnILF2-pcDNA3.1+，测序结果显示目的基因序列及读码框均正确，表达载体构建成功。
TnIL-21cDNA序列长849bp，其中5UTR长69bp，3UTR长342bp，ORF长438bp。根据TnIL-21ORF推导的多肽长145个氨基酸，分子量为16.5kD。在TnIL-21多肽含有1个由22个氨基酸组成的N端信号肽及多个修饰位点和功能结构位点，如N-糖基化位点、磷酸化位点和亮氨酸拉链等。TnIL-21成熟肽含有4个α-螺旋结构，4个半胱氨酸残基(Cys61，Cys68，Cys110，Cys113)和1个谷氨酰胺残基(Gln133)。氨基酸序列比较显示，TnILF2与其它物种IL-21蛋白的相似性很低，只有20％～49％。TnIL-21仅在正常鱼体组织的鳃、肠和性腺中有少量表达，LPS刺激能诱导TnIL-21在头肾和脾脏中表达。基因定位比较显示，IL-21基因在黑青斑河豚、红鳍东方豚以及人类中具有保守的共线性。将TnIL-21CDS序列克隆到原核表达载体pET32b中，成功地构建重组载体TnIL21-pET32b，并建立其原核表达体系，成功诱导目的蛋白的大量表达。
TnILF2和TnIL-21基因的鉴定和克隆以及表达载体的构建，为以后开展基因功能研究奠定了基础。