【摘 要】
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根据Zadori报道的小鹅瘟病毒(GPV)全基因序列,针对高度保守性的GPV-VP3基因核苷酸序列用Oligo软件设计一对引物,经液相PCR扩增出了预期长度为441bp的片段。在此扩增片段范围
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根据Zadori报道的小鹅瘟病毒(GPV)全基因序列,针对高度保守性的GPV-VP3基因核苷酸序列用Oligo软件设计一对引物,经液相PCR扩增出了预期长度为441bp的片段。在此扩增片段范围内,应用Oligo软件设计长度为34bp的寡核苷酸探针,建立了能特异的从感染雏鹅组织石蜡切片中检测出小鹅瘟病毒核酸的间接原位PCR方法。将小鹅瘟病毒通过口服、滴鼻、肌肉注射三个途径感染7日龄雏鹅,同时设置同居组和对照组,攻毒后在不同时间点分别采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、胸腺、哈氏腺、法氏囊、大脑、食道、气管等组织,应用建立的间接原位PCR方法检测小鹅瘟病毒在雏鹅体内的动态分布规律。结果表明:1.建立了间接原位PCR从石蜡切片中检测小鹅瘟病毒的方法。通过对引物特异性检测,探针特异性和敏感性检测,液相PCR对结果的验证以及相关文献支持,证明该方法特异性强、灵敏度高,并且能在组织细胞水平定位核酸。同时根据斑点杂交结果计算出探针可检测约16.25pg的同源DNA。2.应用建立的间接原位PCR方法检测小鹅瘟病毒在雏鹅体内的动态分布规律,结果表明不同感染途径GPV侵染机体的顺序不一致:①口服组在攻毒后4h,即可在食道中检测到GPV DNA,而其它组织在攻毒后12h检测到GPV DNA。GPV DNA含量随攻毒时间的增加逐渐增加,其中肝脏、脾脏、法氏囊、肺脏、大脑、哈氏腺GPV DNA含量较高。②肌肉注射组在攻毒后4h可在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊、胸腺、哈氏腺检测到大量GPV DNA,而其它组织在12h后才能检测到大量GPV DNA。③滴鼻组在攻毒后4h可在气管检测到GPV DNA,12h后在其它组织检测到GPV DNA,其含量与口服攻毒组相当。④口服同居组攻毒后48h可在食道检测到GPV DNA,72h后可在其它组织检测到GPV DNA。⑤滴鼻同居组攻毒后72h可在食道检测到GPV DNA,9d后才能在其它组织检测到GPV DNA。⑥肌肉注射同居组检测结果与滴鼻同居组结果相同。3.根据同居检测结果分析发现,三个同居组GPV最先感染的组织器官都是食道,检测结果与口服攻毒组检测结果相同。可以推测,小鹅瘟病毒在本实验同居组中可能是通过饮水、食物、粪便、分泌物等途径进入口腔感染雏鹅机体。
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