论文部分内容阅读
突变体是进行基因功能鉴定的重要材料，而构建起大规模的突变体库则是进行功能基因组学研究的重要内容。构建突变体库的方法多种多样，有诱变法、同源重组、基因沉默、插入突变等。因插入突变法容易获得旁侧序列，从而快速克隆突变基因，因而较其他方法更具优越性。目前，作为植物学研究的模式植物，拟南芥的插入突变体库近乎饱和，水稻的插入突变体库也达到一定规模，但同样拥有重要研究价值的油菜，有关插入突变体库的研究却较少。
我们利用激活标签载体pXT246转化甘蓝型油菜宁油12号，对T1和T2的表型进行了统计，对T2部分植株基因组T-DNA插入片段的侧翼序列进行了扩增，对激活标签载体pXT246进行了改造并转化了拟南芥研究了其表达情况，主要的研究内容和结论如下:
1.利用农杆菌介导的浸花法将激活标签载体pXT246转化到甘蓝型油菜宁油12号，通过浓度为0.2‰的Basta初筛与PCR分子鉴定获得了40株转基因植株。观察发现，T1在叶片颜色、叶片形态、花瓣颜色、花瓣形态、雌蕊、角果颜色、角果形态、植株分枝数目等方面出现了显性性状的表型。
2.T2株系中有子叶、花、角果以及株型等性状变化明显，如叶片数目减少;叶片颜色变深绿;叶片表面光泽度高;叶片叶形为心型;雄蕊数目改变;有效分支数增加或减少;有高大植株也有矮小植株等。另外也发现，高大植株中有部分开花期也提前，矮小植株中有部分开花期延后，同时叶片颜色也较深绿。但在以上表型中，符合孟德尔分离规律的株系只有有效分支数减少的AN27株系和苗期叶片表面积变大的AN39株系。对于AN27和AN39转基因株系，用限制性酶切位点步移PCR、Tail-PCR、PCR-Walking方法扩增突变体T-DNA插入片段侧翼序，目前还未得到侧翼序列，扩增方法的优化仍待进一步研究。
3.为了更加有效地筛选转基因植株，我们在激活标签载体中加入根特异启动子驱动的红色荧光蛋白，以期在刚刚萌发时，下胚轴露出时，检测到红色荧光蛋白，从而分离出转基因的种子。将激活标签载体pXT246的GFP基因切下，连上RFP以及拟南芥根特异性表达启动子基因，转化拟南芥，用抗生素PPT筛选转基因株。经PCR分子鉴定后的确为拟南芥转基因株，待收获种子后检测红色荧光蛋白以确定该载体是否能用作油菜激活突变库的转化载体。