麻疯树高效再生体系的建立及纳米载体转基因技术研究

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麻疯树(Jatropha curcas L.)是一种重要的生物柴油树种,生长迅速,喜光耐旱,具有较高的经济价值和药用价值。本文以麻疯树无菌苗茎段为外植体,进行麻疯树植株再生的研究;同时,建立麻疯树悬浮细胞系,探索纳米基因载体对麻疯树遗传转化的效果,从而建立一种新的基因转化方法。主要研究结果如下:(1)采用麻疯树无菌苗茎段为外植体,初步建立了麻疯树植株再生体系,结果表明:麻疯树茎段诱导不定芽再生的最适激素组合为:BA1.Omg/L+TDZ1.5mg/L,不定芽的平均诱导率达69.25%。不定根诱导培养中,采用生长素NAA诱导麻疯树幼苗生根,最适诱导配方为:MS+NAA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L,生根率达到66.67%,根系粗壮,发育良好。外植体接种于MS固体培养基和液体培养基中均有不定芽分化,但固体培养基中的外植体不定芽诱导率更高,褐化水平也较低。(2)麻疯树悬浮细胞培养中,研究了疏松愈伤组织诱导方案及不同培养条件对麻疯树悬浮细胞生长的影响。结论如下:麻疯树疏松愈伤组织诱导的最适培养基及激素组合为:MS+2,4-D0.6mg/L+KT0.4mg/L,此培养基上诱导出的愈伤组织湿润松散,颜色鲜艳。接种愈伤组织进行悬浮培养的液体培养基最适激素组合为:NAA0.2mg/L+2,4-D1.0mg/L+BA0.5mg/L。初代、2次继代和4次继代的愈伤组织用于悬浮培养时,以初代愈伤组织较为适宜,悬浮培养系中的细胞分散度最高。培养基中添加500mg/L水解酪蛋白可以有效地促进悬浮细胞的生长,使悬浮培养系的生物量增加。悬浮细胞振荡培养过程中,摇床转速应低于120rpm,以110rpm为宜。(3)以微乳液法制备了淀粉纳米基因载体,并对载体进行了表面修饰。结果表明:淀粉纳米载体(SNGC)制备的最优实验方案为淀粉浓度15%、搅拌速度2000rpm、油水相体积比15:1、三氯氧磷0.05%。采用多聚赖氨酸(PLL)对淀粉纳米载体(SNGC)进行表面修饰,PLL与SNGC的质量比不同,载体表面携带的电荷数量也不同。当SNGC:PLL(M:M)=2:1时,载体表面电荷数达到饱和。修饰后的PLL-SNGC为球状颗粒,大小比较一致,分散性好。多聚赖氨酸(PLL)和水溶性量子点(CdSe)两种材料修饰后的PLL-SNGC和Cs-PLL-SNGC载体均能有效的与DNA分子结合。(4)纳米基因载体对麻疯树愈伤组织和悬浮细胞的转化结果表明:用PLL-SNGC和Cs-PLL-SNGC两种纳米基因载体溶液处理过的麻疯树愈伤组织生长良好,载体基本无细胞毒性,或者细胞毒性很小,对细胞正常的生长、分裂几乎没有影响,可以用作麻疯树遗传转化的载体。两种纳米基因载体对麻疯树愈伤组织的转化效果均不明显,但对悬浮细胞的转化具有比较明显的效果,并且载体在细胞内可以自行降解,具有良好的生物相容性。麻疯树悬浮细胞转化中,超声处理时间以10min较为适宜。
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