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提高作物氮素利用效率对保障全球粮食安全起到举足轻重的作用,围绕作物氮素利用效率的研究已成为植物营养遗传学研究的热点。植物分子生理学研究结果显示,寡肽转运蛋白(OPT)参与了植物氮素吸收转运与利用,对植物氮利用效率提高有着显著的影响。本论文以我国第二大粮食作物玉米为研究对象,选用目前常规育种广泛使用的骨干自交系掖478及以其为背景的3个导入系IL8、IL26、IL65为试验材料,采用RT-PCR克隆玉米寡肽转运蛋白基因,并进行生物信息学分析,通过亚细胞定位和半定量PCR进行表达分析研究,主要研究内容和结果如下:
1.根据玉米B73和水稻的寡肽转运蛋白全长序列设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法从玉米自交系掖478中克隆到了寡肽转运蛋白基因,命名为ZmOPT0212(基因登录号:HM021150)。ZmOPT0212开放阅读框为2151bp,编码716个氨基酸残基、等电点8.87、相对分子质量为77.4kDa。
2.生物信息学分析,寡肽转运蛋白其二级结构约含43.85％的α-螺旋、3.91％的β-转角、13.27％的延伸链和38.97％的不规则卷曲,含有14个连续的疏水片断,其中12个可能构成跨膜螺旋；预测该转运蛋白不存在信号肽,可能存在于细胞膜上。保守结构域预测编码蛋白属于OPT蛋白家族。通过蛋白功能预测,该蛋白具有转录、转录调控、信号转导、金属离子转运、转运及与底物结合等功能。同源性和进化树的预测分析显示,ZmOPT0212蛋白与水稻、拟南芥、毛果杨和蓖麻等高等植物的寡肽转运蛋白同源性分别达到了99％、96％、92％和92％。
3.亚细胞定位,构建融合表达载体35s-GFP-ZmOPT0212,用基因枪转入洋葱表皮细胞观察其在细胞中的定位,结果显示转化质粒在洋葱表皮细胞的细胞膜部位有明显的荧光,初步证明ZmOPT0212位于细胞膜中。
4.半定量分析结果表明,在非胁迫条件下,ZmOPT0212基因在幼嫩叶和根部都有表达。同样方法分析在非生物胁迫条件下掖478及其三个导入系中目的基因,发现该基因在叶和根中均有表达。以掖478表达为参照,胁迫条件下IL26中ZmOPT0212基因的表达量一直持上升趋势,而其他两个导入系的表达情形都是在氮胁迫初期有迅速的增加,随后趋于稳定或者有所下降。