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N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)及其脱乙酰基衍生物氨基葡萄糖(GlcN)是重要的功能单糖,在医药、食品和化妆品领域均有广泛的应用,主要功能包括修复软骨组织、提高抵抗力、作为膳食补充剂、减缓细胞衰老等等。目前,微生物发酵产GlcNAc由于其成本低、工艺条件温和以及生产方式环保符合可持续发展原则等优点,已经成为最有发展前景的GlcNAc合成方法。谷氨酸棒状杆菌具有易培养、不产孢子、免受噬菌体侵染等特点,本论文采用食品安全级生产菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032作为出发菌株进行课题研究。首先打通目标产物GlcNAc的转运途径以及阻断GlcNAc在发酵后期时的重新利用,促进目标产物GlcNAc的积累;随后选择最佳底盘菌株,强化GlcNAc合成途径,将碳代谢流拉向产物GlcNAc的合成途径,提高GlcNAc合成浓度;最后优化发酵条件,增加发酵培养基中的谷氨酸棒状杆菌菌株密度,使GlcNAc合成浓度得到进一步的提高。本论文通过一系列实验研究来促进重组谷氨酸棒状杆菌发酵合成GlcNAc,提高葡萄糖转化率,为重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产GlcNAc奠定了一定的基础,研究结果总结如下:(1)阻断重组谷氨酸棒状杆菌中GlcNAc的消耗降解途径和打通重组谷氨酸棒状杆菌中的GlcNAc转运系统。通过敲除谷氨酸棒状杆菌基因组中的乙酰氨糖特异性磷酸转移酶基因cgl2642阻断胞外GlcNAc转运至胞内,敲除基因cgl2642的重组谷氨酸棒状杆菌的胞外GlcNAc产量与未敲除cgl2642的菌株相比,发酵时间越久,菌株C.g4-pec-cglS-ScA与C.g2-pec-cglS-ScA的GlcNAc积累浓度差值越大,最后在48 h时,C.g4-pec-cglS-ScA的GlcNAc浓度达到2.310 g/L,相比较提高17.26%,转化率为0.039 g/g glucose;通过过表达大肠杆菌来源的6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB来构建重组谷氨酸棒状杆菌中的GlcNAc转运系统,重组菌株 C.g4-pec-cglS-ScA-PXMJ-B 合成 GlcNAc 的浓度提升至 4.037 g/L,是对照菌株C.g4-pec-cglS-ScA的2.4倍,转化率为0.067 g/g glucose。(2)通过优化底盘菌株和强化重组谷氨酸棒状杆菌中的GlcNAc合成途径,促进GlcNAc的合成。通过在四种底盘菌株C.gl(△nagA/B△ldh)、C.g2(△nagA/B△1dh/△poxB)、C.g3(△nagA/B△ldh/△cg12642)、C.g4(△nagA/B△ldh/△poxB/△cg12642)中构建 GlcNAc 合成途径和加强 GlcNAc 转运途径,对各个菌株进行发酵验证,发现△poxB(乙酸途径)的敲除非必须操作,底盘菌株C.g3(△nagA/B△ldh/△cg12642)在构建GlcNAc合成途径和加强GlcNAc转运途径后的GlcNAc积累浓度最佳,提升至5.278 g/L,比菌株 C.g4(△nagA/B△ldh/△poxB/△cg12642)提高 10.88%;通过对 GlcNAc合成途径中的两个关键酶GlmS和GNA1的最佳来源进行筛选优化,强化重组谷氨酸棒状杆菌中的GlcNAc合成途径,研究过表达大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌来源的glmS对重组谷氨酸棒状杆菌合成GlcNAc的影响,结果表明在重组谷氨酸棒状杆菌中过表达枯草芽孢杆菌来源的glmS为最佳选择,重组谷氨酸棒状杆菌合成GlcNAc浓度提升至16.776 g/L,相比较提高220.40%,转化率为0.280 g/g glucose;随后进一步研究过表达秀丽隐杆线虫、酿酒酵母来源的GNA1对重组谷氨酸棒状杆菌合成GlcNAc的影响,结果表明在重组谷氨酸棒状杆菌中过表达秀丽隐杆线虫来源的GNA1稍好一些,重组谷氨酸棒状杆菌合成GlcNAc浓度提升至17.084 g/L,相比较提高1.84%,转化率为0.285 g/g glucose。(3)对重组谷氨酸棒状杆菌合成GlcNAc的发酵条件进行优化,确定发酵培养基中的葡萄糖浓度为60 g/L,玉米浆浓度为10 g/L;摇瓶发酵时菌株OD600为50左右;对IPTG诱导剂的诱导时间进行优化,确定在发酵5 h时(OD600≈2.5)进行添加,此时GlcNAc合成浓度提升至17.711 g/L,相比较提高15.72%;对IPTG诱导剂的添加浓度进行优化,确定IPTG诱导剂添加浓度为0.8 mM,此时GlcNAc合成浓度提升至18.175 g/L,转化率提高至0.303 g/g glucose。最后采用流加发酵模式进行重组谷棒菌株合成GlcNAc的5L罐发酵优化,通过葡萄糖反馈流加方式控制合理的发酵糖浓度,对菌株发酵密度以及GlcNAc合成浓度进行改善,最后5L罐发酵的重组谷氨酸棒状杆菌菌株OD600提高至120,菌株合成GlcNAc浓度提高至83.0 g/L,转化率提高至0.305 g/g glucose。