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细胞凋亡(Apoptosis)是现代生命科学研究的热门领域,在哺乳动物、线虫和果蝇中,细胞凋亡的研究非常广泛,凋亡的分子机制也取得了较大的进展。虽然细胞凋亡的分子机制在整个生物进化过程中是高度保守,而且哺乳动物细胞凋亡途径与昆虫细胞凋亡途径有许多相似之处,但也存在许多不同的地方,比如细胞凋亡的线粒体通路中,在哺乳动物的细胞凋亡中是由于细胞色素C从线粒体释放到细胞质中,与细胞质中的Apaf-1结合,从而活化caspase,进而导致细胞凋亡的发生。而在果蝇和线虫的细胞凋亡中,细胞色素C的作用却与哺乳动物的不太一致。但是鳞翅目昆虫细胞凋亡研究显示Cyto C的作用与哺乳动物细胞凋亡相似,即凋亡细胞过程中发生Cyto C的释放等事件。由于Cyto C在线粒体信号通路中具有重要的作用,而且迄今有关鳞翅目昆虫细胞凋亡过程中Cyto C释放的检测、定位或无细胞体系研究等均是以哺乳动物Cyto C和其抗体进行的,由于Cyto C在鳞翅目昆虫和双翅目昆虫细胞凋亡中的作用存在差异,为揭示和阐述Cyto C在鳞翅目昆虫细胞凋亡过程中的作用及其分子机制,我们拟克隆和表达斜纹夜蛾(Spodoptera litura) Cyto C,利用内源性Cyto C系统为研究鳞翅目昆虫细胞细胞色素C介导线粒体信号途径的地位与作用奠定基础。本文克隆了鳞翅目昆虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)的细胞色素C基因,构建了细胞色素C蛋白的原核表达重组质粒(pET-28a-Cyto C)和真核表达重组质粒(pIZT/V5-His-Cyto C),并实现了细胞色素C基因的原核表达。首先利用细胞色素C在不同物种中保守性较高的特点,根据家蚕(Bombyx mori)和果蝇(Drosophila)的细胞色素C序列的高度保守区设计一对简并引物,利用Trizol法提取斜纹夜蛾(SL-1)细胞中的总RNA,经反转录和PCR扩增,得到一条长247bp的cDNA序列；然后以这条序列为基础,设计了几组3’-RACE和5’-RACE特异性引物,再利用SMART RACE技术克隆了SL-1细胞的细胞色素C的3’端和5’端序列；最后通过拼接得到一个长801bp细胞色素C的cDNA序列,该cDNA包含一个327bp的开放阅读框,编码108个氨基酸,在3端有一个长247bp的非编码区(不含ployA尾),5’端有一个长172bp的非编码区。NCBI序列比对,显示它与果蝇(Drosophila)和家蚕(Bombyx mori)的细胞色素C序列的同源性分别为80%和82%。得到SL-1细胞的细胞色素C的cDNA全长序列后,根据其开放阅读框设计引物,通过PCR扩增出细胞色素C的开放阅读框,利用Nde I和Hind Ⅲ对其进行双酶切,再将其连接到pET-28a载体上,构建了原核表达重组质粒(pET-28a-Cyto C);同时,利用Kpn I和Xba I对PCR产物进行双酶切,并将其连接到pIZT/V5-His载体,构建真核表达重组质粒(pIZT/V5-His-Cyto C)。原核表达重组质粒构建成功后,先用不同浓度(终浓度为0.4mM、0.6mM、0.8mM)的IPTG对其进行诱导表达,表达产物利用SDS-PAGE电泳分析,后利用His抗体、Western blot方法对表达的重组蛋白进行鉴定验证。斜纹夜蛾细胞色素C基因的克隆、原核与真核表达质粒的构建和细胞色素C的原核表达,为细胞色素C抗体的制备及其在细胞凋亡中的功能和定位的研究打下了坚实的基础。