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超临界流体色谱(Supercritical Fluid Chromatography,简称SFC)是一种高效的色谱技术,兼备了气相色谱和液相色谱的一些特点,更是二者的重要补充。SFC具有分离效能高,分析时间短,低有机溶剂消耗及环境友好等的优点。近年来,随着分离技术及仪器的不断发展,SFC技术的应用也不断拓展,并逐渐延伸到中药领域。甾体皂苷是一类重要的、具有多种生物活性的中药成分,尤其是在心脑血管疾病防治方面活性显著:如以甾体皂苷为主要成分的中药制剂地奥心血康胶囊、心脑舒通和宫血宁等。同样,甾体皂苷单体化合物也具有很好的药理活性及开发潜力,比如知母皂苷BII,药理研究显示其能显著上调胆碱能受体、改善脑缺血及其缺血损伤、改善学习记忆,而且安全性良好。目前已有的一系列分离、分析手段,如硅胶柱层析、C18开放柱、制备型HPLC等用于分离纯化甾体皂苷,高效液相色谱(HPLC)甚至超高效液相色谱(UPLC)和质谱联用等用于甾体皂苷的分析,解决了甾体皂苷很多的分离和表征问题,但是一些同分异构体类甾体皂苷化合物的分离分析还存在一定的难题。前期研究表明SFC在螺甾皂苷的分离上具有一定的优势。为了拓展SFC在甾体皂苷分离中的应用,本课题系统研究了各色谱参数对SFC分离甾体皂苷的影响,优化了SFC分离甾体皂苷的色谱条件及参数,总结归纳了SFC分离甾体皂苷的特点。甾体皂苷由甾体皂苷元和糖链组成,根据甾体皂苷元结构的不同可以分为呋甾皂苷和螺甾皂苷。呋甾皂苷一般在C-3和C-26位连有糖链,而螺甾皂苷一般F环闭合只有C-3位连接糖链。由于螺甾皂苷的F环环合,而呋甾皂苷的F环开裂及C26-OH多与葡萄糖成苷,二者的结构差异较大,色谱行为也存在较大差异。而且,呋甾皂苷的C22-OH比较活泼,容易与甲醇或乙醇等发生作用,产生甲氧基化或乙氧基化产物。因此,将螺甾皂苷与呋甾皂苷两类化合物分别进行分析,优化相应的SFC色谱参数,得到各自适用的色谱条件。首先,我们以18个螺甾皂苷单体和2个螺甾皂苷的混合物为对象,系统地考察了色谱柱、改性剂、添加剂、背压和温度等参数对SFC分离脂溶性螺甾皂苷的影响,确定了各色谱参数对SFC分离螺甾皂苷的影响程度:色谱柱>改性剂>添加剂、背压和温度。色谱柱中填料键合极性基团的Diol柱和DEA柱较适用于分离螺甾皂苷;不同改性剂中甲醇的洗脱能力最强;酸性、碱性或者盐类添加剂对改善螺甾皂苷的分离度没有帮助;温度和背压对螺甾皂苷在色谱柱上的保留的影响较小。根据螺甾皂苷的极性大小和结构特点,将这20个螺甾皂苷分为四组,分别优化各组的色谱条件,使每组在sfc上都得到最佳的分离效果。我们观察了螺甾皂苷分子的糖链中糖基的数目、种类及苷元上的羟基、双键的数目、位置等对化合物保留时间及分离度的影响,总结了sfc分离螺甾皂苷的特点。diol柱适用于分离极性偏大的螺甾皂苷,不适用于分离极性较小的螺甾皂苷元;而hssc18sb柱对螺甾皂苷元和糖基较少的螺甾皂苷有较好的分离。极性较小的螺甾皂苷及螺甾皂苷元在sfc上的保留时间短,糖基个数多的螺甾皂苷在sfc上的保留时间长。同时,利用hplc对这四组螺甾皂苷进行了分离,并且将sfc与hplc的分离结果进行了比较。通过比较四组的分离结果发现,sfc分离苷元相同、糖基不同的螺甾皂苷的分析时间短,分离效果好。sfc对糖链相同、苷元上羟基不同的螺甾皂苷的分离也有明显优势。而hplc对苷元上双键不同的螺甾皂苷有较好的分离。因此,sfc和hplc(反相c18)在分离螺甾皂苷上具有一定的互补性。其次,我们以3个呋甾皂苷单体及其对应的甲氧基化产物为对象,系统考察了色谱柱、改性剂、添加剂及柱温等对sfc分离呋甾皂苷的影响。在考察不同色谱柱对呋甾皂苷分离的影响时发现,由于改性剂甲醇的使用,在洗脱过程中呋甾皂苷的c22-oh发生了甲氧基化反应,而且色谱柱填料对呋甾皂苷甲氧基化程度的影响不一样。其中diol柱上呋甾皂苷甲氧基化的程度较大,1-aa柱上呋甾皂苷发生转化的程度较小,但是diol柱对呋甾皂苷的分离能力更强,峰容量更大,因此选择diol柱作为固定相。接着考察不同改性剂对呋甾皂苷分离的影响,结果为以纯甲醇作改性剂时色谱分离过程中易发生甲氧基化;纯乙醇作改性剂时分离过程中也会发生乙氧基化,程度明显弱于甲醇。但由于乙醇的洗脱能力较弱,色谱峰形较差,峰容量降低,因此选择甲醇作为改性剂。还考察了不同添加剂对呋甾皂苷分离和甲氧基化程度的影响。酸性添加剂对呋甾皂苷的分离没有影响,甲氧基化程度较大;而甲醇中加入碱性添加剂(氨水)后,呋甾皂苷的甲氧基化明显得到抑制,有较好的分离效果。同时还考察了不同量的氨水对呋甾皂苷的影响,发现ph值增大,对甲氧基化抑制作用的影响不明显,不过会增强呋甾皂苷在色谱柱上的保留,色谱峰形变差。在甲醇(含0.2%氨水)中再加入3%h2o,结果表明3%h2o并未降低碱性添加剂对呋甾皂苷甲氧基化的抑制作用,而且能够增强流动相的洗脱能力,改善色谱峰形。并且考察了分离过程中温度对呋甾皂苷的影响。温度升高,呋甾皂苷在色谱柱上甲氧基化程度增加;温度降低,呋甾皂苷在色谱柱上的保留增强。经过优化确定了分离呋甾皂苷的色谱条件:diol柱为固定相,超临界co2-甲醇/水(97/3,v/v)(0.2%氨水)为流动相,柱温为40°c,背压为1600psi。因此,sfc不仅用于脂溶性螺甾皂苷的分离,也能够用于水溶性呋甾皂苷的分离。最后,本课题还利用SFC-Q-TOF/MS对10个呋甾皂苷的混合样品进行了分离,以及黄姜药材提取物进行了分离表征,并且利用质谱信息鉴定了黄姜提取物中19个甾体皂苷的可能结构。总之,本论文对SFC分离脂溶性螺甾皂苷和水溶性呋甾皂苷的色谱条件进行了系统考察,了解了SFC分离甾体皂苷的常规条件,总结了SFC分离甾体皂苷的色谱行为规律及特点,还利用了SFC对主含甾体皂苷的中药黄姜提取物进行了有效的分离表征。SFC在分离脂溶性螺甾皂苷上有明显优势,并且与反相液相色谱形成互补。同时,SFC也能够用于分离水溶性呋甾皂苷。因此,SFC可以应用于极性天然产物的分离分析。