【摘 要】
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抗病相关基因是植物分子生物学研究的热点领域之一。脂肪酸alpha双加氧酶(fatty acid alpha-Dioxygenase)是近年来植物中发现的一类重要的抗病相关基因,已在多个物种中相继发
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抗病相关基因是植物分子生物学研究的热点领域之一。脂肪酸alpha双加氧酶(fatty acid alpha-Dioxygenase)是近年来植物中发现的一类重要的抗病相关基因,已在多个物种中相继发现并得以克隆。脂肪酸alpha双加氧酶参与脂肪酸alpha氧化过程,该代谢通路可以产生各种参与植物抗逆过程及生长发育调节的脂类信号分子。Alpha-DOX拟南芥中有两个拷贝,分别命名为DOX1和DOX2。为了深入分析DOX1和DOX2的生化功能和表达模式,本论文展开如下研究:对拟南芥DOX1和DOX2进行系统的生物信息学分析。Rare codon Caltor密码子偏爱性分析显示,DOX1基因读码框中含有78个大肠杆菌稀有密码子,占总密码子的12%;DOX2中有88个大肠杆菌稀有密码子,占总密码子的14%。疏水性分析表明这两个蛋白可能含有跨膜区。获得拟南芥DOX1和DOX2基因并构建对应原核表达载体。通过RT-PCR对DOX1进行了克隆,从拟南芥资源中心(ABRC)获得DOX2。将DOX1和DOX2基因构建于原核表达载体pGEX-5X-1,获得重组质粒pGEX-DOX1和pGEX-DOX2。表达纯化DOX1和DOX2并测试其过氧化物酶活性。将构建好的两个重组质粒分别转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)-RIPL codon+,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot结果表明融合蛋白在BL21 (DE3)-RIPL codon+中得到了高效表达,二者融合蛋白表观分子量都约为98KD。经GST亲和柱层析进一步纯化DOX2获得了可溶性重组蛋白。愈创木酚法测试表明可溶性重组蛋白不具有过氧化物酶活性。发现DOX1可能存在可变剪切。用水杨酸处理的材料中克隆到的DOX1存在两种形式,一种与公布的结果一致,另一种则多保留了一个内含子。这种新的剪切体新产生的蛋白为截短的目的蛋白。这种可变剪切存在的意义还不十分清楚,有待进一步研究。上述研究为拟南芥脂肪酸alpha-双加氧酶功能的最终阐明奠定了基础。
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