论文部分内容阅读
[目的]2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)的遗传背景与基因多态性密切相关。Caveolin-3 (Cav-3)是肌肉特异性蛋白,它可以调节胰岛素信号通路。课题组前期研究发现T2DM病人Cav-3基因外显子存在多处变异位点。为了观察Cav-3基因突变是否影响胰岛素受体信号途径,改变骨骼肌细胞糖代谢,从而参与T2DM的发病机制,我们将Cav-3 K15N突变基因导入C2C12细胞,对其表达的突变蛋白进行相关功能研究。[方法]利用生物信息学预测Cav-3第一外显子K15N (KU971296)、 D16H和N33N三个突变点蛋白质的二级结构,然后选择二级结构改变明显的K15N突变进行研究。分别构建阴性对照组、野生型组以及Cav-3 K15N突变组表达载体转染C2C12细胞。G418筛选后,胰岛刺激30min,运用Western Blot技术和IF技术鉴定Cav-3、AKT、pAKT以及GLUT-4等蛋白的表达情况；在12h、24h测定C2C12肌细胞对葡萄糖的摄取量和36h细胞内糖原合成量。[结果]1.分析发现K15N、D16H属于错义突变,N33N属于同义突变。生物信息学预测Cav-3蛋白质二级无规则卷曲结构变为螺旋结构的有K15N和D16H两个位点。2.经400μg/ml的G418筛选后,得到稳定表达的细胞系。Westernblot鉴定证实筛选成功,组间转染效率没有统计学差异。3.与野生型组相比,K15N突变使骨骼肌细胞Cav-3蛋白总体表达降低,而且富集在细胞核周围,细胞膜分布减少。其下游信号分子AKT磷酸化减少,但总AKT蛋白表达水平无明显变化。细胞GLUT-4蛋白不仅总体表达水平下降,而且在细胞膜上聚集成团。4.Cav-3 K15N突变蛋白导致C2C12细胞对葡萄糖摄取减少。在12h,K15N突变组与阴性对照组和野生型组相比,p值分别等于0.042和0.000；在24h,K15N突变组与野生型组比较p=0.010,有显著的统计学差异,但是与阴性对照组相比p=0.366,没有统计学意义。在36小时K15N突变组细胞糖原合成减少(p<0.050)。[结论]Cav-3 K15N突变导致C2C12细胞膜Cav-3表达减少,影响胰岛素信号通路上AKT磷酸化和GLUT-4蛋白的转位,导致骨骼肌细胞葡萄糖摄取障碍,糖原合成减少。我们推测骨骼肌细胞利用葡萄糖减少可能会引起高血糖,是促使T2DM发生发展的机制之一。