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因创伤、感染、肿瘤等各种原因造成的骨缺损、骨不愈合一直是骨科治疗领域的难题。常用的自体和异体骨移植各有自身难以克服的缺点，不能常规用于临床。随着组织工程的迅猛发展,为骨缺损修复提供了新的思路和治疗途径。 构建理想的的组织工程化骨其前提就是要有生物学特性良好的种子细胞和适合的支架材料,支架材料的选择是组织工程所需考虑的关键问题之一。理想的骨组织工程的支架材料应该满足以下几个条件: (1)良好的生物相容性。 (2)生物可降解吸收性以及吸收速率的可调性。 (3)一定的机械强度和韧性,在特定的部位能提供与局部环境相适应的结构上的支持作用。 (4)易于加工、塑行以便临床用。 (5)具有三维内联多孔结构，种子细胞的黏附生长以及周围组织的长入决定了材料必须具备完备适宜的多孔性,包括一定的空隙率、孔径大小以及完善的内连接系统。 (6)材料表面有利于细胞黏附生长、分化。目前在骨组织程中常用的支架材料主要有生物陶瓷、羟基磷灰石(HAP)、人工可降解聚合物等，而多种成分的复合型支架材料的逐渐成为研究热点。 本单位与上海大学高分子材料研究所合作采用干铺-烧结的方法联合研制了一种新型生物复合材料―HA/ZrO2梯度复合材料(Graded irconia-hydro xyap at- ite composite bioceramic)。使氧化锆材料的高强度、高韧性和HA的生物活性有机地结合起来。根据国际标准化组织ISO10993-1:1992医疗器械生物学评价标准和要求，本课题组已对HA/ZrO2梯度复合材料进行了一系列体内外实验研究，前期研究发现HA/ZrO2梯度复合材料具有良好的骨诱导性和骨传导性，无细胞毒性、无急性体内毒性、不致溶血性，生物相容性和免疫相容性良好，成骨效能优，能够与骨界面形成良好的生物连接。 骨组织工程中的种子细胞要求其扩增迅速,与支架材料有良好的相互作用,骨髓间充质干细胞(MSCs),因其可通过体外贴壁培养分离,扩增迅速,是一类具有分化潜能的细胞,在特定条件下可以分化为多种组织细胞,如成骨细胞、软骨细胞、肌腱、脂肪细胞、成纤维细胞以及神经星状细胞等,且具有极强的自我复制能力,是一种理想组织工程种子细胞。以骨髓间充质干细胞和HA/ZrO2梯度复合材料复合构建的组织工程化骨有望成为未来骨组织工程研究和应用的主流。 组织工程学的重要研究内容之一是支架材料对种子细胞生物学行为的影响。目前HA/ZrO2梯度复合材料对MSCs生长及分化的影响尚未得到充分阐明。本研究旨在详细阐述作为支架材料的HA/ZrO2梯度复合材料对于种子细胞MSCs生长及成骨分化等生物学行为的影响，为未来的相关应用提供数据参考。 实验分3个部分进行观察研究： 1.骨髓的获取及MSCs的分离培养。用密度梯度离心法进行MSCs的原代分离培养、消化传代，绘制 MSCs的生长曲线及倍增时间。同时进行相关实验内容的检测分析包括MSCs的成骨诱导分化、Vonkossa染色、碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶（ALP）活性测定、总RNA提取及RT-PCR。 2.HA/ZrO2复合材料颗粒对骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化的影响。以不同浓度的材料悬液作用于骨髓间充质干细胞，5天后进行MTT检测。15天后进行碱性磷酸酶活性测定、Voncossa染色、总RNA提取及RT-PCR。 3.骨髓间充质干细胞在HA/ZrO2梯度复合材料、HA/ZrO2单纯复合材料、纯HA及ZrO2四种不同材料表面上贴壁增殖及成骨分化的差异。将细胞以相同浓度接种于不同材料薄片表面进行贴壁增殖实验。分别于1、4、7、11天后解离细胞并计数，绘制生长曲线并计算倍增时间。 ALP检测：分别于第10、20天裂解细胞后测碱性磷酸活性及总蛋白含量。均以普通孔板底面为对照。 通过以上研究，为新型生物复合材料-HA/ZrO2梯度复合材料的相关应用提供参考数据。 实验获得以下主要结果和结论： 1.本研究采用密度梯度离心法所分离得到的MSCs纯度高，经体外成骨诱导可向成骨细胞方向分化。 2.HA和含有HA的复合材料颗粒均对细胞增殖有一定促进作用。而单纯ZrO2颗粒对细胞增殖没有促进作用。对于细胞分化，实验结果显示HA和含有HA的复合材料颗粒均对细胞ALP表达有一定促进作用，说明HA和含有HA的复合材料颗粒均可促进MSCs的成骨分化。 3. MSCs接种于HA/ZrO2梯度复合材料、HA/ZrO2单层复合材料、纯HA及ZrO2四种不同材料基质表面，细胞均可贴壁、增殖与成骨分化。但其贴壁、增殖与分化的特征表现为复合材料基质更有利于细胞贴壁和增殖，以梯度复合材料为最好；梯度复合和单层复合薄片上细胞ALP活性可升高，说明其对MSCs的成骨分化有一定的促进作用。 4.HA/ZrO2梯度复合材料与MSCs良好复合，有利于MSCs生长和促进细胞成骨分化，因而更适合作为组织工程支架材料。