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Bacillus subtilis K91是从云南腾冲热泉中筛选出的一株嗜热菌,最适生长温度为50℃。通过对其全基因组测序及注释分析,发现在其基因组序列中含有一段酯酶基因CarEW。本研究通过异源表达及纯化得到重组酯酶CarEW,并对其酶学性质及对农药马拉硫磷和增塑剂邻苯二甲酸二异丁酯(Diisobutyl phthalate,DiBP)的降解机制进行了探讨,具体研究结果如下:(1)从嗜热Bacillus subtilis K91中扩增得到酯酶基因CarEW的全长序列。CarEW全长1464 bp,编码487个氨基酸,理论分子量大小为53.76 kDa,等电点4.88。CarEW具有典型的Gly-X-Ser-X-Gly五肽结构域,其催化三联体由Ser189-Glu289-His388组成,预测可能的活性位点是Ser。CarEW编码的氨基酸序列与GeneBank中来源于Bacillus pumilus(AAU04567.1)中的羧酸酯酶相似性为99%,但是其功能目前还未见报道。(2)重组酯酶CarEW酶学性质的测定。以对硝基苯酚丁酸酯(p-NPC4)为底物,重组酯酶CarEW最适pH 7.5,最适温度45℃;在pH 6.5~9.5范围内保温60 min,能保持60%以上的酶活力;在37℃和45℃保温60 min,酶活力分别保持在54%和58%以上;K+、Na+、Cu2+、Zn2+对酶有激活作用;Hg2+、Mn2+、Fe2+、Ag+抑制酶的活性;TritonX-100、DTT和SDS、CTAB抑制酶的活性;异丙醇、乙醇、甲醇对酶有激活作用;重组酯酶CarEW可以水解碳链长度小于等于12的对硝基苯酚酯,该酶的最适底物为p-NPC4,Km值和Kcat值分别为0.8mM和1792 s-1;重组酯酶CarEW对不同碳链长度的底物有很好的水解活性,在机溶剂中稳定性较好。(3)重组酯酶CarEW能够水解马拉硫磷和DiBP。用重组酯酶CarEW分别与14种农药和增塑剂DiBP反应,结果显示:重组酯酶CarEW有很强的底物特异性,仅能够水解有机磷类农药中的马拉硫磷,而对于其它农药没有水解活性。0.3 U重组酯酶CarEW在37℃反应60 min可以水解68%的马拉硫磷,水解后生成无毒的马拉硫磷一元酸和马拉硫磷二元酸;重组酯酶CarEW还可以水解DiBP,10 U的重组酯酶CarEW在37℃反应120 min可以水解92.5%的DiBP。水解DiBP生成一异丁酯(Monoisobutyl phthalate,MiBP)和邻苯二甲酸(Phthalate acid,PTH),同时CarEW也可以水解Mi BP生成PTH。重组酯酶CarEW水解DiBP的效率大于Mi BP,Kcat/Km值分别为0.109 s-1 mM-1和0.031 s-1mM-1。(4)成功构建了酯酶CarEW在E.coli BL21(DE3)表面展示的基因工程菌。用Pseudomonas syringae KCTC1832冰核蛋白的N端作为锚定蛋白与酯酶CarEW融合,构建重组质粒pET28-N/CarEW,转化到E.coli BL21(DE3)中,通过细胞表面定位分析证明酯酶CarEW成功定位到细胞表面,表面展示重组菌最适温度45℃,最适合pH为8.0,能够水解碳链长度小于10的对硝基苯酚酯,与纯化重组酯酶CarEW相比表面展示重组菌具有长时间的稳定性,该研究为酯酶CarEW在生物修复中的应用奠定了基础。