论文部分内容阅读
恶性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)是皮肤肿瘤中侵袭性最强,致死率最高的恶性肿瘤。早期黑色素瘤可以通过手术切除,患者5年生存率可以达到95%,但是晚期或手术不可切除的黑色素瘤仍然是目前黑色素瘤治疗的巨大挑战。2011年以前,化疗和靶向治疗是治疗晚期黑色素瘤的主要手段,由于受到靶点和毒副作用的限制,仍然仅对40%-50%的黑色素瘤患者有效。近年来,随着对免疫治疗研究的不断深入,晚期黑色素瘤治疗进入了一个新的阶段。免疫治疗不受肿瘤突变情况的影响,其治疗效果主要取决于患者自身的免疫状态。并且,黑色素瘤具有较高的免疫原性,肿瘤细胞周围存在着丰富的免疫细胞,免疫治疗能更有效的激活宿主免疫系统,发挥杀伤肿瘤细胞的作用,因此认为免疫治疗可能是治疗晚期黑色素瘤最有前景的治疗手段。目前应用于临床的免疫治疗方法主要包括肿瘤疫苗、细胞因子、溶瘤病毒、过继性细胞免疫治疗和免疫检查点抑制剂,其中免疫检查点抑制剂ipilimumab、nivolumab和pembrolizumab在晚期黑色素瘤免疫治疗中取得了备受瞩目的治疗效果,成为了人类治疗肿瘤的一个里程碑。目前研究结果表明,阻断PD-L1/PD-1途径可以显著增强机体抗肿瘤免疫应答,是治疗晚期恶性黑色素瘤的重要靶点。由于PD-L1同时表达于肿瘤细胞和APC中,以PD-L1为靶点可以在T细胞激活的初始阶段和效应阶段同时发挥抗肿瘤免疫应答,同时临床研究结果也提示抗PD-L1单抗相比于抗PD-1单抗表现出更持久的应答率和更低的毒副作用,认为PD-L1可能是治疗晚期黑色素瘤更有效的免疫治疗靶点。但是,目前应用于临床治疗的免疫抑制剂仍缺乏较高的特异性,药物的毒副作用以及昂贵的治疗费用也限制了他们的应用,所以,寻找和开发天然的、低毒性药物是目前急需解决的问题。一直以来,天然植物及其提取物被作为非常重要的治疗药物在肿瘤治疗中被广泛研究,表现出较低的毒副作用,易于获得且价格低廉。其中,天然可食用的小分子黄酮类化合物表现出显著的生物学活性,具有低毒性和不诱导突变的生物学特征,在抗肿瘤治疗中受到越来越多的关注。芹黄素(Apigenin,APG),主要存在于蔬菜、水果和饮品中,作为经典的黄酮类化合物在肿瘤治疗中被广泛研究,研究表明其在多种肿瘤类型,包括黑色素瘤中可以发挥抗肿瘤作用。近年来,多项研究表明芹黄素对宿主免疫具有调节作用,可以通过调节宿主免疫应答,发挥抗肿瘤作用。本研究中我们首次发现芹黄素可以通过调节机体免疫来抑制黑色素瘤生长,芹黄素通过同时抑制黑色素瘤细胞和树突状细胞中PD-L1的表达,发挥双重作用恢复和增强机体抗肿瘤免疫应答。因此,本研究阐明了芹黄素抗肿瘤作用的一个新的方向,这可能对治疗恶性黑色素瘤具有潜在的临床意义。实验一程序性死亡配体-1在黑色素瘤细胞中的表达实验目的:研究PD-L1在人黑色素瘤细胞系中的表达水平以及肿瘤微环境中各种细胞因子和生长因子对其表达的影响。实验方法:选取7种经典的人黑色素瘤细胞系,利用Western bolt检测黑色素瘤细胞系PD-L1表达水平,选取PD-L1高表达细胞系用于后续实验;选择在肿瘤微环境中对机体免疫发挥调节作用的细胞因子和生长因子作用于A375细胞系,利用Western bolt检测各种细胞因子和生长因子对PD-L1表达的影响;选取对PD-L1有调节作用的因子,应用Western bolt技术进一步验证其对PD-L1的诱导作用。结果:Western bolt结果表明在黑色素瘤细胞系中PD-L1的表达水平由高至低依次为 RPMI-7951、A2058、A375、MeWo、SK-MEL-3、G361、SK-MEL-28,我 们选取 PD-L1表达水平高的RPMI-7951、A2058和A375细胞系进行后续实验;细胞因子和生长因子诱导实验结果表明IFN-γ在A375细胞系中可以显著上调PD-L1的表达,与空白对照组相比,差异有统计学意义,并且进一步的Western bolt结果显示,IFN-γ同样也可以在其他黑色素瘤细胞系中上调PD-L1的表达。结论:PD-L1在黑色素瘤细胞中广泛表达;IFN-γ诱导的PD-L1上调在黑色素瘤免疫逃逸中起到重要作用;PD-L1在黑色素瘤免疫治疗中起到重要作用。实验二芹黄素通过抑制黑色素瘤PD-L1的表达发挥免疫调节作用实验目的:研究黄酮类化合物在体外和体内对黑色素瘤中PD-L1表达的影响及其作用机制,进而明确其对T细胞免疫应答功能的影响。实验方法:利用细胞增殖实验和流式细胞术检测黄酮类化合物对黑色素瘤细胞增殖和细胞周期的影响;应用免疫荧光和凋亡试剂盒检测黄酮类化合物对黑色素瘤细胞凋亡的影响;芹黄素和姜黄素处理IFN-γ诱导后的黑色素瘤细胞系,通过Western bolt和免疫荧光技术检测其对黑色素瘤细胞PD-L1表达的影响;为了进一步探究芹黄素和姜黄素对黑色素瘤细胞膜表面PD-L1表达的的影响,采用流式细胞术进行检测PD-L1的膜表达水平;应用Western bolt检测STAT1和p-STAT1水平,明确芹黄素和姜黄素影响PD-L1表达的作用机制;应用T细胞杀伤实验,细胞毒性实验和IL-2 ELISA试剂盒检测黄酮类化合物处理黑色素瘤细胞后T细胞对其杀伤的敏感性;应用C57BL/6小鼠建立B16-F10黑色素瘤动物模型,评估黄酮类化合物在体内对黑色素瘤的生长和免疫系统的影响。结果:黄酮类化合物在体外抑制黑色素瘤的生长并且促进黑色素瘤细胞凋亡;黄酮类化合物抑制IFN-γ诱导的PD-L1在细胞内和细胞膜上的表达,并且芹黄素的抑制作用更为显著;芹黄素和姜黄素通过抑制STAT1的磷酸化进而抑制诱导性PD-L1的表达;芹黄素和姜黄素通过抑制A375细胞PD-L1表达增强了 T细胞杀伤肿瘤细胞的能力并且促进T细胞增殖;在体内,芹黄素同样表现出对肿瘤生长的抑制作用并且促进T细胞向肿瘤组织浸润。结论:芹黄素通过抑制黑色素瘤细胞PD-L1表达,恢复和增强T细胞杀伤黑色素瘤细胞的能力,促进淋巴细胞向黑色素瘤组织浸润,通过发挥免疫调节作用进而抑制黑色素瘤的生长。实验三芹黄素通过抑制宿主树突状细胞PD-L1表达发挥抗黑色素瘤免疫调节作用实验目的:研究芹黄素对树突状细胞PD-L1表达的影响及其对宿主免疫的调节作用。实验方法:分离黄酮类化合物治疗后小鼠脾脏中的树突状细胞,应用Western bolt检测PD-L1的表达;分离人外周血单核细胞中的树突状细胞,用黄酮类化合物处理成熟的树突状细胞,Western bolt检测PD-L1的表达;从人外周血单核细胞中分离DC和CIK,体外诱导其成熟,将黄酮类化合物处理后的DC与CIK共培养杀伤黄酮类药物处理的A375细胞,应用克隆形成和细胞毒性实验检测其对肿瘤细胞的杀伤能力。结果:Western bolt结果表明,黄酮类药物可以显著抑制小鼠和人外周血树突状细胞PD-L1表达,芹黄素表现出更显著的抑制作用;克隆形成和细胞毒性实验结果表明DC可以增强CIK杀伤肿瘤细胞的能力;黄酮类化合物处理的DC细胞与CIK共同培养,可以增强DC-CIK杀伤黑色素瘤细胞的能力,芹黄素表现出更强的促进作用。结论:芹黄素抑制小鼠和人外周血树突状细胞PD-L1表达,与CIK共同培养在T细胞激活的初始阶段增强宿主免疫进而增强机体杀伤黑色素瘤细胞的能力。