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酶是生物体内活细胞产生的高效高特异性生物催化剂,在生命活动中发挥着无可替代的重要作用。酶传感器以酶为分子识别元件,具有选择性好和灵敏度高等诸多优点。自Clark和Lyons于1962年首次提出酶传感器以来,随着生物、化学、物理学、医学和电子技术等相关学科的迅速发展,酶传感器凭借其具有其它生物传感器所无法比拟的优势而发展成为分析化学学科中最为活跃的研究领域之一。显然,对固定化酶进行酶活性分析和检测是评估酶固定方法优劣、优化酶固定材料和构建新型高效酶生物传感器的重要手段和主要依据。本学位论文中,我们简要综述了压电传感技术、安培酶电极和酶活性分析的近期进展,基于固定化酶生物活性测试和酶固定材料和方法的优化开展了以下研究工作：(1)考察了电化学或化学预氧化儿茶酚胺(CA)在普鲁士蓝(PB)修饰电极上的电聚合,籍此高效包埋固定葡萄糖氧化酶(GOx)、实现了对葡萄糖的灵敏安培生物传感。所涉及的CA包括多巴胺(DA)、L-去甲肾上腺素(NA)和肾上腺素(EP),详细研究了以DA为单体的预氧化-电聚合固定酶法所构建的传感器的性能。利用电化学石英晶体微天平(EQCM)监测了电极修饰过程,并对几种化学预氧化剂和阳极电化学预氧化电位进行了筛选和优化。与常规电聚合法相比,预氧化步骤明显提高了所得传感器性能。在优化条件下所得传感器对葡萄糖的检测下限(LOD)为0.30μM,灵敏度为35μA mM-1cm-2,稳定性和抗干扰性好,且在-0.05 V检测电位下亦有优良分析性能。紫外可见光谱法和EQCM法检测结果证实所固定的GOx酶比活性(ESA)高,基于NA聚合物的酶膜性能与DA聚合膜的基本相当,但EP聚合低效且其酶膜的生物传感性能差。(2)K3Fe(CN)6快速化学氧化DA和NA产生相应的化学氧化聚合物(PDAC和PNAC)并同时有效包埋GOx。将该酶-高分子复合物滴干于金电极表面,并用壳聚糖(CS)进一步固定构建了高性能生物传感器和生物燃料电池(BFC)。所得CS/PDAC-GOx/Au酶电极对葡萄糖灵敏度高(135μA mM-1 cm-2)、LOD低(0.07μM)、响应时间短(小于3 s)、抗干扰能力好。而且,该传感器热稳定性良好,在30℃下使用寿命达两个月,在60℃下寿命为三周。此外,该传感器在以苯醌(BQ)或二茂铁甲酸(Fc)为电子媒介体的第二代传感模式下亦具有良好的分析性能,BQ和Fc的使用极大地拓宽了该传感器的线性范围(对BQ为2.0μM～48.0 mM,对Fc为2.0μM～16.0 mM)并显著提高了葡萄糖饱和电流密度(高达8.0 mA cm-2)。利用这些人工电子媒介体在酶膜中良好的渗透性,我们根据已有动力学模型对所固定的GOx及其酶活进行了定量分析,结果表明CS/PDAC-GOx/Au电极上实现了酶的高负载量、高活性固定。同时,CS/PDAC-GOx/Au作为生物阳极构建的BFC最大功率密度达1.62 mW cm-2,优于目前所报道的大多数BFC。(3)结合DA易吸附易聚合的性质和多壁碳纳米管(MWCNTs)的高导电性,以GOx为模型酶,在磷酸缓冲液(PBS)中合成DA-MWCNTs-GOx复合物并通过过量DA的电化学氧化聚合实现了GOx在石英晶体微天平(QCM)金电极表面的高效固定。结果表明,导电纳米材料MWCNTs的引入改善了DA单体在电极表面的电沉积,实现了酶的高效包埋。同时,不导电聚多巴胺膜(PDA)赋予了该传感器优良的抗干扰能力。所制备的PDA-MWCNTs-GOx/Au酶电极对葡萄糖的检测灵敏度高(60±3.2μA mM-1 cm-2)、LOD低(0.20μM)、线性范围宽且抗干扰能力强。(4)活性蛋白(如酶)在界面的吸附在科研、工业和医学等领域具有广泛意义。吸附酶的构象和取向将显著影响吸附酶性能。因此,通过控制吸附条件实现对吸附酶性能的有效调控在众多领域都具有重要应用价值。本章采用EQCM和紫外可见光谱法研究了GOx在裸金电极和多种短链巯基化合物(R-CH2-SH,R=-CH3,-CH2OH,-COOH或-CH2NH2)修饰金电极上的吸附,同时对所得吸附酶的酶活性及酶与电极间的直接电子传递进行了研究。实验结果表明通过增大吸附液中离子强度和适当降低酶浓度能显著改善吸附酶的活性。优化条件下,在电极表面可吸附固定同时具有高酶活性和高电活性的酶。(5)重金属(HM)离子与酶的相互作用是许多领域的重要研究课题。本章以GOx为例,提出了一种基于QCM和电化学分析技术的综合实验平台,用于研究HM离子与酶的相互作用并对HM离子进行了安培抑制分析。通过阳极安培检测酶生H2O2,研究了HM离子对溶液态GOx (GOxs)、吸附态GOx (GOxads)和聚合物包埋的GOx (GOxe)的酶活性的抑制效果。在所考察的多种HM离子中,Ag+对GOxs、GOxads和NA聚合膜(PNA)包埋的GOxe (GOxe-PNA)表现出最强的抑制效果,检测下限分别为2.0、8.0和5.0 nM。Hg2+、Cu2+和Co2+均需达到15μM以上浓度才开始抑制GOx活性,且浓度高达1.0 mM的Cd2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+和As3+对GOx活性亦无明显抑制作用。基于该实验平台,我们检测并首次报道了GOXads酶活的抑制百分率与一个GOads分子上结合多少个HM离子的对应关系。此外,与其它几种用于酶包埋和酶抑制分析的聚合物相比,PNA对HM离子亲和力小,且对Ag+抑制分析具有最高灵敏度和最小干扰。该实验平台有望很好地用于很多氧化还原事件相关酶的抑制分析及其HM离子抑制效应的定量研究。(6)利用有机磷农药对乙酰胆碱酯酶(AChE)的选择性抑制,进行有机磷的快速高敏检测颇具意义。本章中,我们提出了一种利用溶液态AChE (AChEs)和吸附态AChE (AChEads)快速检测对氧磷(PO)的新方法,并结合QCM与电化学方法对AChE酶活性进行了定量测试。考察了吸附液中离子强度和酶浓度对底物硫代乙酰胆碱及抑制剂PO在所得AChEads/Au电极上响应灵敏度的影响,实验结果表明吸附液中高离子强度和较低的酶浓度更有利于得到对底物及对抑制剂同时具有灵敏响应的AChE。ds。在优化条件下,AChEs和AChEads对PO的LOD分别为0.50和0.80ppb。