论文部分内容阅读
背景:近来研究认为自噬在肿瘤中的发生、发展过程中发挥了重要的作用，然而在肝癌中自噬所扮演的角色仍是有争议的。肝癌微环境中普遍存在多种压力因素，包括血管功能失常或者血管相对不足导致肿瘤内低氧，以及生长因子缺乏、酸中毒等，这些都是可能诱发肝癌自噬的重要因素，然而其中具体的分子机制仍不清楚。前期我们的研究发现肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts，CAFs)是肿瘤微环境中数量最丰富的一类细胞，它和肿瘤自噬同样都在肿瘤的进展过程中扮演了重要的角色，而两者之间是否有潜在的联系尚未有研究。在肝癌中，CAFs对于癌细胞的增殖、存活、侵袭、转移和血管生成等肿瘤恶性转化过程及“促瘤间质”（亦即肿瘤生发的土壤）的形成尤为重要，但是目前关于CAFs如何能够维持其稳定且独特的“恶性表型”从而发挥强大的促瘤作用的分子调控机制尚不清楚。因此本研究将探讨CAFs与肝癌自噬的相关性及CAFs通过增加肝癌自噬而促瘤的分子机制，再进一步深入分析CAFs维持其促瘤表型的分子机制。 方法:本研究第一部分首先在肝癌组织标本中分别对自噬相关的蛋白标记物LC3B的表达、CAFs密度与预后进行分析，然后再将二者进行关联分析，在体内探讨二者的相关性。在体外建立CAFs与肝癌细胞的共培养模型，分析体外CAFs对肝癌自噬的影响。再通过miRNA芯片分析CAFs诱发的肝癌细胞MiRNA表达谱的变化，进而从表观遗传学角度阐明CAFs在肝癌自噬作用中的分子机制。第二部分研究在前期的我们发现CAFs特异性低表达CD13的工作基础上，首先在体内和体外验证CD13的表达水平与CAFs活化表型、体内促瘤生长、促瘤因子的表达等CAFs促瘤功能的相关性，然后通过过表达或沉默等方法改变CAFs中CD13的表达进一步探究CD13对CAFs促瘤表型的影响，再对CD13下游信号通路和胞内结合蛋白的深入研究找到CD13低表达的CAFs维持其恶性表型的机制。 结果:第一部分研究结果发现在肝癌组织标本中，LC3B的表达水平与CAFs密度都与肝癌的总体生存时间和无疾病生存时间呈明显的负相关，而LC3B的表达水平与CAFs密度呈正相关。进一步研究证实癌旁肝脏组织中LC3B表达要高于癌组织，体外实验中正常肝细胞自噬水平也要高于肝癌细胞。同时我们也发现在正常培养的状态下，高侵袭肝癌细胞与低侵袭肝癌细胞相比自噬是减少的，然而在应激状态下（饥饿、化疗药物杀伤）高侵袭肝癌细胞则能通过提高自噬水平从而对抗恶劣的环境。进一步研究发现CAFs细胞培养上清处理或者与CAFs直接共培养后肝癌细胞的自噬水平显著增加，并且CAFs诱导的肝癌自噬增加可以减轻化疗药物的损伤作用。通过对CAFs处理后肝癌细胞进行miRNA芯片分析后，发现CAFs可能通过下调miR19b、miR20、miRNA146、miRNA200的表达而促进肝癌细胞发生自噬。第二部分研究发现CD13低表达相对于CD13高表达的CAFs表达更多的激活型标记物α-SMA和HGF、SDF-1等促瘤因子，体内也显示出更强的促肿瘤生长特性。下调正常肝脏成纤维细胞(Normal liver fibroblasts，NLFs)中CD13的表达后可以使NLFs表型向CAFs表型转化，包括α-SMA、Col1、HGF、SDF-1表达增加。而过表达CAFs细胞中CD13后可以逆转CAFs的恶性表型，包括α-SMA、Col1、HGF、SDF-1表达减少。同时发现CD13低表达后伴有Yap、NF-κB信号活化，免疫共沉淀结果提示CD13可能通过与胞内蛋白结合直接改变相关通路的活性，进而导致CAFs表型相关基因的表达改变。 结论:自噬可能抑制肝癌的发生，而在肝癌进展过程中特别是当肿瘤处于应激状态时自噬更多的是发挥了促癌作用。CAFs能够促进肝癌特别是在应激状态下的自噬的发生，这对于肝癌细胞在化疗药物损伤、缺血、缺营养等恶劣环境下的生存是至关重要的。CAFs可能是通过下调相关miRNA的表达而升高自噬相关的靶蛋白水平从而促进肝癌自噬。CD13是CAFs维持其促瘤表型的负性调控因子，CD13可能通过与胞内蛋白相互作用从而改变Yap、NF-κB的活性从而参与CAFs恶性表型的维持。