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人髓鞘碱性蛋白(Human Myelin Basic Protein，MBP)是神经组织特有的蛋白质，由中枢神经系统(CNS)少突胶质细胞和外周神经系统(PNS)雪旺氏细胞(SC)合成，占髓鞘蛋白质总量的30％，在神经纤维的绝缘和快速传导中发挥重要作用。MBP具有种属、组织细胞特异性和时空表达阶段特异性，对人脑发育、神经细胞分化、髓鞘发生与髓鞘形成具有重要生理作用。MBP不仅存在于神经组织，而且广泛分布于造血系统，其功能更为广泛。在神经科学领域中，MBP及其基因的研究起步早、进展快，迄今仍是人们关注的焦点之一。MBP在神经细胞的生长、发育和分化过程中究竟是促进细胞生长、增殖或是抑制生长、诱导细胞凋亡?这方面的有关研究报道目前国内外尚存争议。弄清楚MBP对细胞增殖和凋亡的确切作用，不仅对人脑发育、神经细胞分化、髓鞘发生与髓鞘形成等基础研究具有重要意义，而且对CNS疾病发病机理与诊治等临床研究无疑具有广泛应用价值。本课题在本实验室系列研究的基础上，应用我室构建的含人Ⅰ型胶原基因调节元件(COLIAl)-MBPcDNA基因，经脂质体介导转染大鼠皮质神经元细胞、大鼠骨髓基质干细胞和人神经星形胶质瘤细胞(U-251)，同时转染含入神经生长因子(NGF)和人脑源性神经营养因子(BDNF)的基因pSVCEP-NGF-CAT、pSVCEP-BDNF-CAT的细胞为阳性对照，转染空载体pSVCEP-CAT的细胞为阴性对照。通过细胞形态和微结构改变的观察、MTT增殖曲线测定、ELISA检测、流式细胞分析、DNA琼脂糖电泳、免疫细胞化学分析、免疫斑点杂交、Western杂交和TUNEL原位杂交等多种方法，从细胞与分子水平观察和研究四川大学博士学位论文了MBP、NGF和BDNF等基因神经及相关细胞中表达及其对细胞增殖和凋亡的影响。 实验结果证明MBP、NGF、BDNF基因分别在神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形胶质瘤细胞(U一251)中成功表达，表达产物具MBP特异抗原活性。MTT法研究显示，21 .skDaMBP以及NGF和BDNF对神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形胶质瘤细胞(U一251)三种细胞的增殖均有明显的促进作用，与空载体转染对照组细胞相比，21 .skDaMBP、NGF和BDNF转染细胞具有明显的抗凋亡作用。HE染色显示，21 .SKDa MBP及NGF、BDNF基因转染细胞经相同浓度HZOZ处理后，其细胞形态结构无明显改变。电子显微镜观察显示，相同浓度和时间处理的21 .skDa MBP及NGF、BDNF微基因转染细胞的超微结构未见明显凋亡改变。DNA琼脂糖电泳显示H20:处理的空载体对照组DNA显现出细胞凋亡所特有的阶梯状条带(DNA Ladder)，而2 1 .skDa MBp及NGF、BDNF基因转染组细胞的DNA琼脂糖电泳图谱未见DNA Ladder。TIJNEL原位荧光标记显示，正常对照组细胞由于核内DNA末降解，因此不会被荧光物标记，细胞核显淡绿色;HZO:处理的空载体转染组细胞发生凋亡、DNA分子大量缺刻或断裂，3’端游离一OH基被荧光物标记，细胞核呈棕黄色;HZO:处理的21 .skDaMBP及NGF、BDNF基因转染组细胞绝大多数与正常对照组相似，细胞核显淡绿色，仅少数个别细胞被标记成淡黄色。流式细胞仪分析显示，HZO:未处理的细胞其自然凋亡率平均为3.57%;空载体对照组转染神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形胶质瘤细胞(U一251) HZO:处理后，其细胞凋亡率显著升高，相同处理的ZI.skDaMBP基因转染细胞其细胞凋亡率不足空载体转染组的三分之一。Fas和Caspase一3免疫组化法初步证实空载体对照组转染神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形胶质瘤细胞(u一251)HZoZ处理后，其细胞Fas和Caspase一3表达显手四川大学博士学位论文著升高，相同处理的ZI.skDaMBP基因转染细胞其细胞Fas和CasPase一3表达则无明显改变。 以上实验证实本室构建的psCEP一MBP一cAT、pSVCEP一NGF一CAT、pSVCEP一BDNF一CAT基因含有相应的目的基因MBP、NoF、BnNF插入片段，经LipofeetAM创ETM转染、筛选分别获得了含目的基因的神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形胶质瘤细胞(U一251)并使目的基因21 .skDaMBP、NGF和BDNF分别以上细胞中成功获得表达。对于HZO:处理神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形胶质瘤细胞 (U一251)，21.skDaMBP与NGF和BDNF一样能显著抑制HZ仇处理对细胞的凋亡诱导、促进细胞增殖。在我室构建的基因基础上，上述实验首次证实21 .skDa MBP基因能有效在体外培养的神经元细胞、骨髓基质干细胞和人神经星形胶质瘤细胞(U一251)中表达;并具有显著促进细胞生长、增殖和抑制细胞凋亡的作用;进一步为陈俊杰教授提出“21 .skDaMBP可能在人脑的早期发育阶段具有促进脑生长发育、细胞增殖的生理作用”的假设和我室报道的含第二外显子的21.skDa MBP早在第8周胎龄人脑脊髓前角和延脑第四脑室底的神经元前体细胞中开始表达的现象提供了相关的证据。 关键词ZI.skDa MBP细胞增殖细胞凋亡神经元细胞骨髓基质干细胞U一251若