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普鲁兰酶是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键,从而剪下整个侧枝,形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶能最大限度利用淀粉原料,因此在淀粉加工工业上具有重要用途。目前普鲁兰酶主要在高浓度麦芽糖、抗性淀粉、高葡糖浆、啤酒、饲料以及酒精生产中应用,并展示了巨大的应用价值。由于淀粉水解过程温度较高,迫切需要筛选产生耐高温的普鲁兰酶的菌株。本文旨在从土壤中筛选出新的耐热普鲁兰酶产生菌,对其进行了形态特征、生理生化特征和分子生物学鉴定。此外,建立普鲁兰酶的分离纯化方法,并对纯酶进行酶学性质研究。并通过优化发酵培养基及发酵条件和诱变育种提高耐热普鲁兰酶产生菌的产酶能力,同时主要研究结果分述如下:1.耐热普鲁兰酶产生菌的筛选与鉴定。通过固体平板初筛和摇瓶复筛从某火山口的土壤样品中分离筛选获得一株产耐热普鲁兰酶的菌株T-10,发酵液中普鲁兰酶活力为1.22U/mL,经形态特征观察、生理生化特征实验以及16SrDNA序列同源性分析,确定菌株T-10是解淀粉芽孢杆菌。2.普鲁兰酶的分离纯化和酶学性质研究.粗普鲁兰酶经过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析洗脱和SephadexG-75凝胶层析洗脱,得到分子量大小约为80KD的电泳纯普鲁兰酶。纯化的普鲁兰酶的比活力为16.06 U/mg,纯化倍数达到45.71倍,酶活回收率为4.33%。普鲁兰酶的最适温度是60℃C,在70℃C条件下保温4 h后活力残留60%以上;.最适pH值为6.0,pH 3.0～8.0在室温保存4 h后相对酶活力大约为70%,具有很好的热稳定性和较为广泛的pH值稳定性。该普鲁兰酶是I型普鲁兰酶,普鲁兰糖为最适底物。A13+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Fe2+和Pb2+对普鲁兰酶的抑制作用随着其浓度的增加而加深;Ca2+、Co2+、Ba2+、Mg2+和NH4+在低浓度时对普鲁兰酶具有一定激活促进作用,浓度过高则会产生抑制作用;EDTA、Cu2+和Hg2+在低浓度就会对普鲁兰酶产生强烈的抑制作用;Na+和K+对普鲁兰酶有一定促进作用,浓度对其影响较小。普鲁兰酶动力学参数米氏常数Km为0.023mmol/L,最大反应速度 Vmax 为 32.23μmol/min。3.产耐热普鲁兰酶菌株T-10发酵培养基及发酵条件优化.通过单因素试验、Plackett-Burman试验和Box-Behnken响应面试验优化产耐热普鲁兰酶菌株T-10的培养基成分和发酵条件,得到最优发酵培养基和发酵条件为:可溶性淀粉含量21.7g/L、大豆蛋白胨含量16.0g/L、硝酸钾含量7.0g/L、磷酸氢二钾含量1.5g/L、七水合硫酸镁含量0.3g/L、培养基初始pH7.0、接种量2%、发酵温度37℃C、摇床转速180rpm、发酵时间16h。在此条件下测得普鲁兰酶酶活力为5.04U/ml,与预测值4.82U/ml偏差为4.33%,说明回归模型能较好地预测普鲁兰酶酶活力。通过对发酵培养基及发酵条件的优化,使最终酶活比初始酶活力提高了 313%。研究菌株T-10的生长与产酶曲线,普鲁兰酶的生物合成模式是同步合成型。4.产耐热普鲁兰酶菌株T-10的诱变选育。分别采用UV诱变、NTG诱变和ARTP诱变3种方法对产耐热普鲁兰酶菌株T-10进行诱变选育,选育产耐热普鲁兰酶酶活力高的稳定的突变菌株。通过计算致死率,结合相关研究结论,在其他条件确定的情况下,确定UV处理时间为30 s、NTG浓度为0.2mg/mL、ARTP处理时间为10 s。最终每种方法都得到了 2株高产的突变菌株。经10次传代培养,得到能稳定遗传且酶活力提高最多的突变菌株N1,其普鲁兰酶酶活力为6.74U/mL,相对于原始菌株提高了 32.26%。按照优化的发酵培养基和发酵条件在10.L发酵罐中发酵突变菌株N1。当发酵时间在18h,酶活达到最大值11.84U/ml,相比于摇瓶发酵,提升了 1.76倍。