【摘 要】
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糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）是我国栽培范围最广、消费量最大的食用菌,其产量和品质显著受到包括氮素在内的众多营养元素的影响。虽然氮素是糙皮侧耳生长发育的必需大量元素,但对糙皮侧耳氮代谢的分子机制尚不清楚。据报道,谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）通过可逆催化氨和α-酮戊二酸生成谷氨酸而在生物体碳氮代谢途径偶联中发挥着至关重要的作用,高效表达G
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糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）是我国栽培范围最广、消费量最大的食用菌,其产量和品质显著受到包括氮素在内的众多营养元素的影响。虽然氮素是糙皮侧耳生长发育的必需大量元素,但对糙皮侧耳氮代谢的分子机制尚不清楚。据报道,谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）通过可逆催化氨和α-酮戊二酸生成谷氨酸而在生物体碳氮代谢途径偶联中发挥着至关重要的作用,高效表达GDH基因可提高生物体的氮素同化和抗逆境胁迫能力。本文通过对 P.ostreatus PC 15全基因组分析,获得了一个功能注释为“glutamate dehydrogenase 2”的假定基因PLEOSDRAFT40761,将其命名为 PoGDH。为了深入探究糙皮侧耳PoGDH基因的功能及其在氮素同化中的作用,本文以河南省广泛栽培的糙皮侧耳New 831菌株作为试验材料,首先克隆获得了该基因的gDNA和CDS片段,并对其进行了测序和生物信息学分析。在此基础上,本研究利用本实验室改造的原核表达载体pCold-TFV,对PoGDH蛋白进行了原核诱导表达、纯化、酶学性质分析和分子量测定;利用酿酒酵母真核表达系统Saccharomyces INVSc1（pYES2/NT A）对 PoGDH蛋白进行了真核诱导表达、亚细胞定位分析和酶活性测定等;通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了 PoGDH基因的时空表达模式,以及不同氮素浓度处理不同时间对PoGDH基因表达影响。本文的主要结论如下:1.分别以P.ostreatus New 831菌丝体的基因组DNA和cDNA为模板,成功克隆获得了PoGDH基因的全长gDNA片段（4,209 bp）和CDS片段（3,135 bp）。生物信息学分析结果显示:PoGDH基因由20个外显子、19个内含子和一个3’UTR组成;其编码产物含有1,044个氨基酸,与NAD[H]依赖型GDH（NAD[H]-GDH）具有较高的同源性;PoGDH蛋白单体的分子量和等电点分别约为117 kDa和6.11;与其它真核生物来源的GDH蛋白相同,PoGDH蛋白的空间结构也为同源六聚体。2.利用本实验室改造的冷休克表达载体pCold-TFV成功表达出了可溶性的TFV-PoGDH融合蛋白,并进一步对该融合蛋白进行了纯化和酶学性质分析。结果显示:TFV-PoGDH融合蛋白诱导表达的最佳条件为0.3 mM IPTG、16℃诱导12h;SDS-PAGE结果显示TFV-PoGDH融合蛋白单体的大小约为170 kDa,与预测结果相符;利用镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的TFV-PoGDH融合蛋白,进一步利用TEV蛋白酶切除该融合蛋白中的TFV标签获得PoGDH蛋白;SDS-PAGE和Native-PAGE测得PoGDH蛋白的分子量分别约为117 kDa和700 kDa,由此证明PoGDH蛋白为同源六聚体,这与前期预测结果相符;PoGDH的辅酶为NADH,其最适反应温度和pH值分别为为30℃和7.5,对NH4+和α-酮戊二酸的 Km 值分别为 2.953 mg/mL 和 0.184 mg/mL,对 L-Glu 的 Km 值为 0.318 mg/mL,由此表明,PoGDH蛋白对α-酮戊二酸具有更高的亲和力,主要催化α-酮戊二酸氨化生成谷氨酸的正向反应。3.为了探究PoGDH蛋白的亚细胞定位情况,本文构建了 PoGDH-GFP融合基因,并利用S.cerevisiae INVSc1（pYES2/NT A）真核表达系统对PoGDH-GFP融合蛋白进行了诱导表达、GDH酶活测定和荧光显微观察等。结果显示:PoGDH-GFP融合蛋白的大小约为144kDa,与预期相符;重组酵母菌株的谷氨酸脱氢酶活性显著高于对照菌株,约为对照菌株的15倍;荧光显微观察结果显示,绿色荧光主要集中在细胞质中,由此表明PoGDH-GFP融合蛋白应当定位于细胞质中。4.PoGDH基因在糙皮侧耳不同时期、不同部位均有表达,其表达量随着生长发育的进程逐渐升高,成熟子实体期的表达量最高;其在成熟子实体不同部位的表达模式为菌柄>菌盖>菌褶。因此,PoGDH基因在糙皮侧耳的不同生长发育时期以及不同部位应当发挥着不同的生理功能。5.不同氮源处理不同时间下的PoGDH基因表达模式存在差异。在缺氮条件下,PoGDH基因表达量随着饥饿时间延长先升高后降低,饥饿处理30 min时的表达量最高。不同形态氮源对PoGDH基因表达的影响不同,其中10 mM Gln和10 mM NH4+对PoGDH基因的表达无显著影响;而10 mM Glu和10 mM Arg处理下的PoGDH基因表达量随处理时间延长而降低。
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