论文部分内容阅读
多形性胶质母细胞瘤(GBM)是成人常见的中枢神经系统恶性神经上皮性肿瘤,其具有侵袭性,导致复发率高,预后差,治疗过程复杂,针对恶性胶质瘤的发病机制及治疗方法的探究一直是肿瘤研究的热点问题。许多研究表明,IKBKE,又称为IKKε或IKKi,是IκB激酶家族中的新成员,其能够调控干扰素和核转录因子κB途径,IKBKE在免疫调节及炎症疾病方面发挥重要作用。最近以来,研究表明IKBKE和多种肿瘤的发生进展相关,被认为是一种致癌性蛋白,它调控胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭,IKBKE在肿瘤生长及进展中起到癌基因的作用。Snail1是一种锌指蛋白转录因子,能够在转录水平上抑制上皮细胞中E-cadherin表达,Snail1的稳定表达能够导致E-cadherin表达缺失及上皮间质化(EMT),从而引起胶质瘤细胞的发生发展、迁移和侵袭。本文研究目的是探讨IKBKE是否对胶质母细胞瘤细胞中Snail1和E-cadherin存在调控作用,进而探究IKBKE-Snail1-E-cadherin通路的存在及功能作用,以及探索IKBKE介导Snail1稳定的分子机制,本项研究通过运用免疫荧光实验和蛋白质免疫印迹法分别探究脑胶质母细胞瘤细胞系中IKBKE和Snail1表达情况,以及两者之间的相互作用。通过划痕实验和Transwell小室法检测IKBKE对胶质母细胞瘤细胞的侵袭和迁移的影响。之后进一步通过免疫共沉淀技术(co-immunoprecipitation,co-IP)和蛋白质免疫印迹法(Western-blot,WB)结合的实验方法深入研究探索IKBKE与Snail1相互结合作用,进一步探索IKBKE介导Snail1稳定的分子机制。方法第一部分IKBKE对肿瘤侵袭和迁移的影响及其与Snail1相互关系的初步研究1.构建IKBKE过表达载体及IKBKE-shRNA慢病毒,以IKBKE过表达质粒转染U118胶质瘤细胞株,上调胶质瘤细胞中IKBKE的表达水平;以IKBKE-shRNA慢病毒转染U87、LN229胶质瘤细胞株,敲低胶质瘤细胞中IKBKE的表达水平;分别通过划痕实验和Transwell小室法检测IKBKE对胶质母细胞瘤细胞的侵袭和迁移的影响。2.通过蛋白质印迹法检测IKBKE和Snail1在GBM细胞系(A172、U251、LN18、LN229、U118、U87、SNB19和LN308)中的表达情况并分析其相关性。3.选取U87、LN229细胞,应用慢病毒载体的IKBKE-shRNA体外分别转染U87、LN229胶质瘤细胞,通过蛋白免疫印迹方法分别检测敲低IKBKE基因后对Snail1蛋白、E-cadherin蛋白表达水平的影响,通过蛋白免疫印迹方法及免疫荧光实验验证Snail1蛋白在细胞浆和细胞核内含量分布的变化。第二部分探索IKBKE对Snail1影响的作用机制4.胶质瘤细胞系U87、LN229细胞经分别提取细胞总蛋白后,分别验证IKBKE及Snail1的表达情况,应用anti-IKBKE抗体对两种细胞总蛋白进行免疫沉淀,同时应用正常兔IgG对细胞总蛋白进行免疫沉淀,作为阴性对照;进而应用WB对免疫沉淀所得复合物进行验证,应用anti-Snail1鉴定anti-IKBKE结合所得蛋白中是否存在Snail1蛋白。接着,同法进行反向验证,anti-Snail1对提取细胞总蛋白进行免疫沉淀,WB对免疫沉淀所得复合物进行验证,anti-IKBKE鉴定anti-Snail1结合蛋白中是否存在IKBKE蛋白。5.使用蛋白酶体抑制剂MG132(20uM)处理U87、LN229细胞和U87-shIKBKE、LN229-shIKBKE细胞,Western blot检测经MG132处理后Snail1在U87、LN229细胞和U87-shIKBKE、LN229-shIKBKE细胞中表达含量并进行比较;使用CHX(50uM)来抑制Snail1蛋白合成,在0,8,16,24,32小时收获蛋白,然后进行Western blot实验检测U87、LN229细胞和U87-shIKBKE、LN229-shIKBKE细胞经过CHX处理后,Snail1蛋白降解的动态变化情况。结果1.划痕实验结果显示,与对照组比较,U87和LN229细胞IKBKE-shRNA处理组细胞迁移距离缩短,迁移能力降低,划痕愈合面积减少,U118细胞IKBKE处理组细胞迁移距离增长,迁移能力提高,划痕愈合面积增大。显示IKBKE表达下调明显抑制了U87和LN229细胞的迁移能力,同时,上调IKBKE表达实验组较对照组明显促进了U118细胞的迁移能力。Transwell基底膜实验显示,U87和LN229细胞中IKBKE-shRNA组细胞穿膜数明显少于对照组,U118细胞中过表达IKBKE组细胞穿模数明显多于对照组;提示侵袭能力在低表达IKBKE的U87和LN229细胞中明显下降,在过表达IKBKE的U118细胞中有明显的增强。2.Western bloting证明胶质瘤细胞系中的IKBKE和Snail1蛋白均高表达。且IKBKE的表达与胶质瘤中Snail1的表达呈显著正相关。3.Western bloting表明,在U87和LN229细胞中,敲低IKBKE基因表达水平后,细胞总Snail1蛋白水平显著降低,E-cadherin蛋白水平上升,敲低IKBKE基因后在细胞浆内Snail1蛋白含量增加,细胞核内Snail1蛋白含量较少。免疫荧光实验结果显示同样结果。4.提取U87、LN229细胞总蛋白后,Western blot验证IKBKE及Snail1在U87及LN229细胞中均表达。应用anti-IKBKE进行免疫沉淀,免疫印迹试验验证anti-IKBKE结合的蛋白中包含Snail1蛋白。反向应用anti-Snail1进行免疫沉淀,免疫印迹试验验证anti-Snail1结合蛋白中包含IKBKE蛋白。5.使用蛋白酶体抑制剂MG132(20uM)处理U87、LN229细胞和U87-shIKBKE、LN229-shIKBKE细胞,Western blot结果显示:无论是否加入MG132,敲低IKBKE组的Snail1蛋白表达均较对照组明显低。而敲低IKBKE组及对照组在加入MG132后,Snail1蛋白表达均有明显增高。为评估Snail1蛋白降解的动态变化过程,我们使用了CHX(50uM)来抑制其蛋白合成,在0,8,16,24,32小时收获蛋白,然后进行Western blot实验,结果显示在敲低IKBKE的胶质瘤细胞中Snail1蛋白的降解速度较正常的U87、LN229细胞中的Snail1蛋白降解的速度快。结论1.IKBKE通过调控促进转录因子Snail1表达水平升高,进而抑制E-cadherin的表达水平,从而导致上皮间质化,促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。相反,通过沉默IKBKE可以降低转录因子Snail1的表达水平,E-cadherin的表达水平恢复正常,进而抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移力。2.IKBKE的表达与Snail1在胶质瘤组织中的表达呈正相关,敲低IKBKE基因表达水平后,细胞总Snail1蛋白水平显著降低,E-cadherin蛋白水平升高,提示IKBKE-Snail1-E-cadherin通路存在的可能,敲低IKBKE基因后细胞浆内Snail1蛋白含量增加,细胞核内Snail1蛋白含量较少,提示敲低IKBKE基因导致Snail1由细胞核向细胞浆内转移。3.本项研究发现IKBKE介导Snail1稳定的分子机制,IKBKE能够直接与转录因子Snail1相结合,IKBKE是通过抑制Snail1的泛素化降解来调控Snail1的稳定性及蛋白含量的。