论文部分内容阅读
硫酸化多糖是天然来源的或经人工改造的生物大分子物质，具有诸多生物活性，如：抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化、抗肾衰等。多糖的活性与其分子结构、分子量、溶解性等因素紧密相关，结构对活性的影响是关键的。多糖的衍生化为多糖带来新的结构，导致了活性的变化。因此，为提高或赋予多糖的生物活性，多糖分子的化学结构修饰具有重要意义。
真菌茯苓是我国传统的用于利尿和镇定的中药，年产量以万吨计。茯苓聚糖是茯苓的主要成分，占茯苓干燥菌核90％以上，开发利用茯苓多糖资源有极大的经济价值。但由于茯苓多糖不溶于水，对其进行结构改造以发挥其生物活性势在必行。本文在已有工作的基础上，利用碱提酸沉法提取茯苓菌核多糖，分别以氯磺酸(Wolfrom法)和氨基磺酸为磺化试剂制备茯苓多糖硫酸酯(PS)。通过单因子和正交实验，研究茯苓多糖硫酸化的反应工艺，通过研究茯苓多糖硫酸化反应的热动力学过程和产品的波谱学特征，探索茯苓多糖硫酸化的反应机制和产物的分子结构信息。以天青A(AA)为光谱探针研究AA与透明质酸(HA)和PS结合反应的特征与机理，以及该方法在测量硫酸化多糖分子量上的应用。以AA为光谱探针研究体内PS药代动力学过程，确定PS用于药效和药理实验的给药途径。以腺嘌呤制作大鼠慢性肾衰模型(CRF)，研究PS防治慢性肾衰的药理机制。以S180肿瘤模型小鼠和Yac-1肿瘤细胞株分别为体内和体外实验对象，研究PS的抗肿瘤活性和免疫调节功能。
本论文提取高纯度茯苓多糖的得率为77.8％，苯酚—硫酸法检测多糖含量为99.2％，25℃时DMSO溶液中的特征粘度[η]为78.95 mL．g-1，粘均分子量为2.15×105Da。
以Wolfrom法制备PS—Ⅰ，得率为75％，比旋光[α]25D是-17.55°，25℃、水溶液的特征粘度[η]是20.1 mL/g，硫酸根取代度DS为2.3，重均分子量为10233 Da。NMR分析结果表明PS—Ⅰ分子所有羟基均发生了取代反应。
以一种改良Wolfrom方法将茯苓多糖和氯磺酸反应制备茯苓多糖硫酸酯PS—Ⅱ。磺化反应的正交实验结果表明，影响产物DS和特征粘度的反应条件顺序是：氯磺酸/单糖残基摩尔比(3-5)＞反应温度(60-80℃)＞反应时间(1-2 h)；茯苓多糖硫酸化反应的热动力学研究结果表明，该反应在50-80℃的反应温度范围内，符合Arrhenius定律，反应的表观活化能是41.9 kJ/mol。在反应温度＜80℃、氯磺酸/单糖残基摩尔比＜5、反应时间＜2 h的温和反应条件范围内，茯苓多糖硫酸酯特征粘度的降低和DS的增加成反比，超过上述反应条件范围，过多的羟基就会由于水解而丢失。13C-NMR图谱表明，系列PS—Ⅱ产品之一(PS—Ⅱ—9，DS 1.55)的C—6羟基被全部酯化，C-2和C—4羟基发生部分硫酸酯化反应。以氨基磺酸制备PS—Ⅲ的单因子实验和正交实验结果表明，以氨基磺酸为磺化试剂制备茯苓多糖硫酸酯的反应条件宜控制在：氨基磺酸/单糖残基摩尔比(A)4-6、反应温度(B)80-100℃和反应时间(C)1-3 h，产物DS变化在0.39-2.68间，分子量变化在52，481-7，244 Da间，[η]变化在124.6-13.9 mL/g间。影响DS和分子量的主次顺序是：B＞C＞A。PS—Ⅲ系列产品之一(PS—Ⅲ-1，DS 0.95)的波谱分析结果表明C—6和C-2羟基发生部分硫酸酯化反应。
硫酸化以后，IR图谱显示硫酸基的特征吸收峰，O—H伸缩振动峰宽变窄，变窄的幅度与DS成正比；NMR图谱显示茯苓多糖碳原子化学位移发生显著变化，发生取代反应的碳原子化学位移由于去屏蔽诱导效应向低场移动，而未发生取代反应的碳原子化学位移由于邻近硫酸基团的屏蔽诱导效应向高场移动，PS的DS越大，碳原子化学位移发生的移动就越大。
光谱探针AA与HA和PS的结合力仍然是静电引力，变色效应的产生是由于相邻结合态AA分子的蒽状杂环(夹氮硫蒽环)之间发生共轭耦合作用。AA可结合HA和PS分子上的羧基和硫酸基产生颜色反应，AA在620 nm处的特征吸收峰随多糖浓度的增大而降低，反应体系颜色的变化是由于新的吸收峰的产生，AA—HA反应的新吸收峰在550 nm处产生，AA—PS的在520 nm处。AA—HA结合反应对温度敏感，当温度大于30℃时，很少有AA—HA复合物的形成，而AA—PS结合反应受温度干扰小，在40℃以上，才会影响到二者的结合，这是由于AA和羧基与硫酸基的结合力不同所导致。
反应体系中盐离子浓度和AA自身浓度的变化可影响AA与硫酸化多糖的结合反应，盐离子浓度越高，反应灵敏度降低，K值降低，N增大；AA浓度增大，K和N值也降低，但反应灵敏度稍微增大。在高AA浓度下，通过N计算得到的多糖分子量高于实际值，通过本章改良的方法计算HA和PS的分子量，更能接近二者实际分子量。
采用光谱探针AA测定大鼠血液中PS—Ⅰ的含量是一种灵敏度高、操作简便、重复性和稳定性好的方法，尤其适合于药代动力学的分析研究。药代动力学分析结果表明血液PS的消除符合一房室、一级消除的开放模型。PS灌胃给药有吸收，但吸收和消除速率均很缓慢，血药作用时间长，PS腹腔注射给药的生物利用度F为69.12％。 PS对CRF有显著疗效，可以减少模型大鼠尿蛋白的排放，升高血总蛋白和白蛋白几乎达到正常水平；增加CRF大鼠代偿性尿量，延长大鼠高尿量时间，降低血清Scr和BUN水平；减轻腺嘌呤在肾小管中的沉积，保护残存肾单位，从而改善肾功能，延缓CRF进程。
PS体外可显著提高NK细胞杀伤活性(P＜0.001)，因此增强NK细胞杀伤活力可能是PS抗肿瘤的重要机制之一。PS体内显著抑制移植性S180肿瘤生长，最大抑瘤率达32.22％(P＜0.005)。显著促进荷瘤小鼠脾脏和胸腺淋巴器官的发育生长(P＜0.05)，体外对小鼠淋巴细胞尤其是B淋巴细胞的增殖有显著促进作用(P＜0.05)，表明PS可以通过促进淋巴细胞增殖，增强机体特异性免疫功能而发挥抗肿瘤作用。PS可以拮抗免疫抑制药所致的免疫抑制。