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自二十世纪90年代,人们开始利用昆虫离体细胞诱导产生抗菌肽,迄今,已经从昆虫双翅目、鳞翅目、鞘翅目的十多个细胞系中诱导产生了抗菌活性物质。与虫体相比,利用离体细胞诱导产生抗菌活性物质,在研究昆虫的不同淋巴细胞的功能特性和细胞因子与受体的特性等诸多理论问题方面存在优势,而利用离体细胞诱导产生抗菌肽在开发新的抗菌药物方面也有较大的应用前景。
我们利用灭活的大肠杆菌DH5a诱导菜青虫(Pieris rapae)胚胎细胞,产生了具有抗菌活性的抗菌物质。同时对已经证明能够诱导产生抗菌肽的581细胞进行转瓶大规模培养与抗菌肽的诱导和分离,这些研究对大规模分离纯化有活性的抗菌肽及大规模基因表达抗菌肽奠定了基础。
利用灭活的大肠杆菌诱导昆虫离体细胞Pr-49和Tn-581细胞,对诱导产物进行抑菌试验,结果显示形成了明显的抑菌圈,Tricine-SDS-PAGE分析,Pr-49细胞诱导后多出了一条分子量约7kd的新蛋白带,而且至少有三条带得到了加强。诱导Tn-581细胞发现多出两条蛋白带。通过对直接取浓缩上清诱导物、浓缩上清和细胞混合物电泳分析,新的蛋白条带为分泌型物质。初步断定培养的昆虫细胞经灭活的大肠杆菌诱导分泌了具有抗菌活性的物质。
灭活的DH5 α诱导转瓶培养的Tn-581细胞,发现细胞上清和有机溶剂浓缩后都产生了抗菌活性物质,而且能够获得大量抗菌活性物质进行随后的分离纯化和双向电泳试验分析。利用凝胶过滤层析发现,抗菌物质混合物经过SephdexG50层析柱后,蛋白多肽混合物难以分开,说明此种蛋白混合物难以应用分子量差异的原理进行抗菌活性物质分离,此步分离可用于样品的脱盐。而双相电泳结果表明,昆虫细胞在诱导前后差别很大,样品中有很多蛋白点对照中不存在,蛋白点集中在碱性一端。
正常生长的大肠杆菌在受到抗菌物质作用后,在不同时间里,被作用的大肠杆菌形态有很大的差异。大肠杆菌被抗菌活性物质作用30分钟后在形态上看不到明显的变化,而作用过夜后(约12小时)细菌内部电子密度增强,质壁出现分离,细胞壁出现空泡并且界限模糊。作用16小时以上电子密度进一步增强,细菌走向老化死亡趋势.电压钳技术为神经生物学中研究离子通道的基本技术,它是通过测定电流的变化来反映膜通透性的情况。我们首次将其用于研究抗菌肽这种小分子量抗菌多肽对细胞膜的作用情况,而受试细胞选择了去掉滤泡膜的爪蟾卵母细胞,更属首次。去掉滤泡膜的爪蟾卵母细胞的细胞膜几乎没有任何离子通道,我们利用它相当于人工脂质体的特点,选择其作为模式细胞。试验结果表明,抗菌物质作用于去掉滤泡膜的爪蟾卵母细胞14min后,检测到了电流的变化,而且表现为外向电流持续升高,推测细胞经抗菌物质作用后有离子通道的产生,此离子通道使得阳离子外流。我们利用电压钳技术研究抗菌肽抗菌机理,将细胞生物学、微生物学、神经生物学知识交叉结合起来,通过电流的变化反映抗菌肽杀菌情况,比较直观地反映了抗菌活性物质与细胞膜相互作用的机制。