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生殖细胞的发生对机体的延续和繁衍起关键作用,是复杂的分子调控过程,vasa、nanos和piwi基因是重要的生殖调控分子,对生殖细胞的发生起调控作用。与模式生物相比,十足目动物生殖调控的分子机制仍不清楚,因此,亟待开展十足目生殖基因的功能研究。本论文在前期研究基础上,以河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)为研究对象,通过Western blot和荧光免疫组织化学揭示了河南华溪蟹VASA蛋白的表达模式,结合RNA干扰技术,对其功能进行了分析,在此基础上,通过检测镉暴露后vasa基因及其相关基因的变化,阐明了镉对河南华溪蟹生殖调控的毒性机制。研究结果如下:1.河南华溪蟹VASA蛋白的表达和定位本实验采用Western blot和荧光免疫组织化学技术,对VASA蛋白在河南华溪蟹卵巢发育不同时期的表达和卵母细胞发育中的定位情况进行了研究。Western blot结果显示,随着卵巢的发育,VASA蛋白量逐渐升高,大生长期开始降低,成熟期达到最低。荧光免疫组织化学结果显示,在卵原细胞中,VASA蛋白均匀分布于细胞质;卵黄发生早期的卵母细胞中,大量VASA蛋白在细胞质中分布,少量开始向细胞核周围聚集;卵黄发生中期、后期和成熟期的卵母细胞中,VASA蛋白主要分布在细胞核周围,且成熟期卵母细胞中VASA蛋白的信号最弱。2.镉暴露对河南华溪蟹VASA蛋白的影响本实验设置了对照组(0 mg/L)和五个镉浓度组(7.25 mg/L、14.5 mg/L、29 mg/L、58 mg/L、116 mg/L),采用急性毒性实验法,研究了镉暴露7 d对河南华溪蟹VASA蛋白表达的影响。Western blot结果显示:随着镉浓度的升高,增殖期和小生长期的卵巢VASA蛋白量均呈现出逐渐降低的趋势;大生长期的卵巢VASA蛋白量呈现出先升高后降低的趋势,镉浓度为14.5 mg/L,VASA蛋白量最高;而成熟期的卵巢VASA蛋白量随镉浓度升高而升高。在此基础上,利用荧光免疫组织化学方法检测了镉暴露后,VASA蛋白在卵母细胞中的变化。结果显示,镉暴露浓度为7.25 mg/L时,VASA蛋白量升高;镉暴露浓度为58 mg/L时,VASA蛋白量降低;浓度升至116 mg/L时,VASA蛋白表达量降至最低。3.河南华溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因部分序列的克隆及表达特征研究表明,vasa基因对nanos1、nanos2和piwi基因的表达有调控作用,为深入研究vasa基因的调控途径,查阅相关资料找出nanos1、nanos2和piwi基因,并进行研究。本实验在前期研究基础上,克隆了nanos1、nanos2、piwi基因的部分cDNA序列。利用半定量PCR分别鉴定了河南华溪蟹nanos1、nanos2、piwi基因的组织特异性表达和在卵巢发育过程中的表达特征。结果显示,nanos1基因在卵巢、精巢、鳃、心和肌肉中均有表达;nanos2基因在卵巢、精巢、副性腺、心脏、肠和肌肉中有较高表达,且卵巢中表达量高于精巢中表达量;piwi基因特异表达于卵巢和精巢。卵巢发育中三个基因的表达时序研究显示,nanos1基因从卵巢发育的增殖期、小生长期、大生长期到成熟期表达量逐渐升高,与之相反,nanos2和piwi基因的表达呈现相反的趋势。4.镉暴露对vasa基因作用分子的影响本实验为验证vasa-siRNA的有效性,检测了vasa-siRNA的干扰效率。结果表明,与对照组相比,vasa-siRNA可显著降低vasa基因的转录水平(P<0.05),干扰效率达到67.4%。在此基础上,研究了镉暴露的效应。结果显示:与阴性对照相比,单独镉暴露7 d后,vasa和piwi基因的表达量显著升高,而nanos基因表达量显著下降;单独注射vasa-siRNA后,vasa、nanos、piwi基因的表达量均显著降低,且与空白对照(0.85%Nacl)无显著性差异;镉暴露同时干扰vasa基因后,与阴性对照相比,vasa和nanos基因的表达量反而显著上升,而piwi基因的表达量显著降低。综合以上研究结果,得出如下结论:(1)随着卵巢的发育,VASA蛋白量先升高后降低,并且随着卵母细胞的发育,VASA蛋白逐渐由细胞质向细胞核周围聚集,表明VASA蛋白在卵母细胞发生过程中发挥作用。(2)揭示了河南华溪蟹nanos1、nanos2和piwi基因的组织特异性及其在卵巢中的表达时序。(3)镉暴露影响了VASA蛋白的表达,且镉可能通过影响vasa及其作用分子nanos、piwi的功能引起河南华溪蟹的生殖毒性。