水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)不定芽发生体系与发育机理的研究

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水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)是我国东北地区重要的珍贵阔叶树种,其材质优良,树形优美,且抗性较强,具有较高的经济价值和景观价值。本文以水曲柳的下胚轴作为外植体,对其不定芽和植株再生进行了系统的研究,并利用植物显微、HPLC及差异显示PCR等技术对水曲柳不定芽再生过程中的组织化学变化、生理生化动态、内源激素动态及基因差异表达进行了研究,分析和探讨了水曲柳不定芽发育的机理。主要研究结论如下:通过成熟种子的下胚轴建立了水曲柳不定芽快速繁殖系统。在MS和WPM两种培养基上均能够诱导出不定芽分别为(83.3%和80.0%),但在MS培养基上外植体死亡现象极为严重,而WPM培养基上外植体死亡率低。在MS培养基上,TDZ比BA更能促进不定芽的诱导;而在WPM培养基上BA则优于TDZ。最佳诱导培养基为WPM+10μMBA;继代伸长培养基为WPM+10μBA+0.05μM IBA;低盐和添加少量的IBA有利于不定芽生根,生根培养基为WPM+0.5μMIBA,幼苗的生根率为81.6%,生根幼苗在温室中驯化成活。通过石蜡制片法,观察组织培养过程中不定芽的形态发生。培养3d时发现,胚轴切口处和韧皮部薄壁细胞分裂已启动;培养第6d时,细胞处于分裂非常旺盛的状态,与顶端分生组织的细胞相似,是典型的分生细胞,排列紧密,细胞质浓、核大、壁薄;9d时,芽原基形成,其细胞排列紧密,染色较深,细胞核明显。通过生理生化指标的研究发现,在水曲柳不定芽再生过程中可溶性糖含量、SOD、CAT.POD.可溶性蛋白、总酚含量、PPO以及核酸呈有规律的变化动态。这些物质含量和组分的变化与细胞的旺盛分裂、不定芽再生的启动以及外植体褐化过程密切相关。可溶性糖、蛋白质含量在不定芽启动过程中呈上升趋势,是不定芽发生的物质基础和能量基础。POD、总酚含量和PPO含量在褐化的外植体中含量最高,表明这些物质的含量与植物细胞在外植体褐化状态下的逆境反应有关。不定芽启动及形成过程中,ZT含量保持着较高的水平。ZT的峰值出现在培养开始后的第6 d。ZT/IAA的比值在不定芽的诱导中起着关键作用。褐化程度越高,ABA含量越高。内源激素水平和外源激素间的平衡对水曲柳的不定芽形成及发育起着重要的调节作用,尤其是激素之间的平衡互作是一个很重要的影响因素。水曲柳不定芽再生过程中DDRT-PCR的适宜反应体系为:5’随机引物数为1个,退火温度为40℃,dNTP浓度100μmol/L。mRNA差异显示结果表明,在水曲柳不定芽发育过程中基因表达有着很大的差异,表现为时序表达,转录水平上的明显差异主要发生不定芽诱导的初期。
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