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家蚕抗菌肽Gloverins是一类分子量较大,富含甘氨酸的抗菌肽。Gloverins由四个同系物组成,它们对革兰氏阴性菌有较强的抑制作用,然而其3—D结构和抗菌机理尚未有报导。BmGlov1是家蚕Gloverins族中最原始的一个同系物,本论文将含有Bm Glov1基因的重组质粒转化至表达宿主菌,诱导原核表达BmGlov1并对其进行纯化。在鉴定其抗菌活性的基础上,进一步利用扫描电镜,透射电镜和激光共聚焦显微镜等技术对其抑菌效果进行观察。
将实验室保存的重组质粒pET—21d—BmGlov1转化至大肠杆菌Rosseta宿主菌,对转化宿主菌进行测序鉴定,确认序列正确后以IPTG对转化宿主菌进行诱导表达。表达产物通过Ni—NTA亲和层析的方法纯化,脱盐处理。采用平板抑菌圈法和最小浓度抑菌法分别对脱盐后产物进行抗菌活性测定。用显示抗菌活性的样品分别对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌杀螟杆菌进行处理,在扫描电镜,透射电镜和激光共聚焦显微镜下分别观察抗菌肽处理菌、无菌水处理菌和醋酸胺处理菌的形态变化,获得如下主要结果:
1.进一步证明原核表达纯化的BmGlov1对革兰氏阴性菌大肠杆菌有较强的抑菌作用,其最小抑菌浓度为1.25μmoL/L,且随着浓度的增大,抑菌效果增强。BmGlov1对革兰氏阳性菌杀螟杆菌也有一定的抑制作用,其最小抑菌浓度为2.5μmoL/L。
2. BmGlov1处理后的细菌与用无菌水和醋酸胺处理后的细菌比较,在形态结构上发生了改变。扫描电镜观察到BmGlov1处理后的杆菌两端出现内陷,高倍的照片还能观察到从杆菌的中间出现干瘪的现象;透射电镜观察到BmGlov1处理后的细菌细胞壁边缘不完整,出现破裂缺口,细胞质不均匀,且明显减少,从菌体细胞壁破裂处有大量内容物溢出。推测扫描电镜所观察到的干瘪现象可能因为细胞壁破裂大量内容物外泄所致。
3.用FITC荧光染料成功地标记了BmGlov1,激光共聚焦显微镜下观察到,标记了的BmGlov1聚集在杀螟杆菌周围,杀螟杆菌的细胞形状清晰可见,随着时间的延长,某些菌体上的荧光信号慢慢消失,而某些菌体的荧光信号也渐变模糊。然而因为放大倍数有限,未能观察到菌体的细微的形态变化,但该方法为进一步同时用其他染料标记菌体细胞核的尝试提供了参考。
本论文对原核表达的BmGlov1抑菌效果的初步研究结果将为进一步阐明BmGlov1的抑菌机制和BmGlov1的3—D结构研究提供基础数据,具有重要的理论意义。